miRNA-182通過調節EMT 相關分子ZEB2而抑制肺癌細胞轉移和侵襲

朱志軍　薛亞軍　朱佳龍(石河子大學醫學院第一附屬醫院心胸外科，新疆　石河子　832000)

miRNA-182通過調節EMT 相關分子ZEB2而抑制肺癌細胞轉移和侵襲

朱志軍薛亞軍朱佳龍
(石河子大學醫學院第一附屬醫院心胸外科，新疆石河子832000)

〔摘要〕目的探討微小RNA(miRNA) -182對肺癌細胞轉移和侵襲的影響及其相關機制。方法采用熒光定量PCR方法檢測肺癌細胞系和組織標本中miRNA-182表達情況;對miRNA-182表達情況與肺癌臨床病理特征關系進行分析;通過Boyden小室分析和傷口愈合實驗檢測miRNA-182對肺癌細胞轉移和侵襲能力的影響;生物信息學方法預測miRNA-182可能的靶基因，并采用熒光素酶報告基因實驗驗證預測的靶基因E盒結合鋅指蛋白2(ZEB2)是miRNA-182的靶基因; Western印跡方法檢測ZEB2、E-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達情況。結果四種肺癌細胞系miRNA-182 mRNA的表達情況為高轉移能力的肺癌細胞系95D和L9981其miRNA-182 mRNA表達顯著低于轉移能力較弱的肺癌細胞系NL9980或95C(P＜0.05)，且同原發性肺癌組織相比，淋巴結轉移癌組織中miRNA-182表達亦顯著下調(P＜0.05) ;臨床病理特征關系分析結果顯示，miRNA-182表達僅與是否存在淋巴結轉移相關。轉染miRNA-182可顯著抑制肺癌細胞系95D和L9981的轉移(P＜0.05)，同時，轉染miRNA-182可顯著抑制肺癌細胞系95D和L9981的侵襲能力(P＜0.05)，而轉染miRNA-182抑制劑可增加肺癌細胞系95D和L9981的侵襲能力(P＜0.05)。生物信息學預測顯示ZEB2為miRNA-182的功能性靶基因，且得到熒光素報告實驗結果證實。Western印跡結果顯示轉染miRNA-182可顯著抑制肺癌細胞系95D和L9981中ZEB2和波形蛋白的表達，上調E-鈣黏蛋白的表達。結論miRNA-182可通過調節ZEB2、E-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達，進而抑制肺癌細胞的轉移和侵襲。

〔關鍵詞〕肺癌; miRNA-182 ;細胞轉移;細胞侵襲; E盒結合鋅指蛋白2

第一作者:朱志軍(1979-)，男，碩士，主治醫師，主要從事心胸外科相關疾病。

微小RNA(microRNA，miRNA)可在轉綠后水平對基因的表達進行負調控〔1〕。miRNA在許多生物過程，包括發育、分化、凋亡、代謝、免疫和腫瘤進展中具有重要的作用。越來越多的證據表明，miRNA可調控腫瘤的發生和發展，并在腫瘤細胞的轉移和侵襲中具有重要的作用〔2，3〕。因此，miRNA可能參與調解肺癌的發生、發展的重要環節。然而，關于miRNA-182在肺癌發生發展中的具體作用及相關機制尚未明確。本研究通過觀察肺癌細胞和組織標本中miRNA-182表達情況，分析其與肺癌臨床病理特征的關系，并在體外轉染miRNA-182后觀察肺癌細胞轉移和侵襲能力的變化，驗證miRNA-182的靶基因E盒結合鋅指蛋白2(ZEB2)，檢測miRNA-182對ZEB2、E-鈣黏蛋白和波形蛋白表達水平的影響，進而探討miRNA-182在肺癌發生發展中的作用及相關機制。

1　材料與方法

1.1細胞及主要試劑人肺癌細胞系NL9980和L9981由四川大學華西醫院四川省肺癌分子重點實驗室惠贈，95C和95D由上海復旦大學生物化學與分子生物學重點實驗室惠贈，細胞培養于含10％胎牛血清(BSA)的RPMI-1640培養基中。轉染試劑Lipofectamine2000及TRIzol購自美國Invitrogen公司，SYBR Green PCR試劑盒、miRNA-182、陰性對照(NC)、antimiRNA-NC和anti-miRNA-182購自Ambion公司;侵襲實驗用Boyden小室購自美國Millipore公司;熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司; ZEB2、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2熒光定量PCR Trizol提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA。PCR反應條件: 95℃5 min，95℃10 s，60℃20 s，共40個循環。引物序列: miRNA-182上游引物: 5'-TTTGGCAATGGTAGAACTCACACT-3'，下游引物: 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG-3';內參照U6上游引物: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。得到的數據通過比較Ct值法(2－△△Ct)進行定量分析。

1.3細胞轉染細胞長至70％融合時可用于轉染。嚴格按照Lipofectamine2000轉染說明書進行操作，轉染36 h后可用于功能實驗。

1.4轉移和侵襲能力檢測采用傷口愈合實驗方法檢測細胞轉移能力，具體操作方法參見文獻報道〔4〕。采用Boyden小室分析檢測細胞侵襲能力，具體步驟:用于實驗的細胞采用臺盼藍染色計數并重懸。將1×105個細胞置于小室上層，并補加培養基至300 μl。下層小室中加入含10％胎牛血清的培養基500 μl。孵育12 h后，未發生侵襲的細胞用棉拭子從上層腔室除去。下層小室中的細胞以0.1％結晶紫固定染色，計算出現侵襲的細胞數。

1.5生物信息學方法預測miRNA-182靶基因通過靶基因預測軟件聯合篩選出ZEB2作為miRNA-182的靶基因。

1.6熒光素酶報告基因驗證靶基因miRNA靶點預測軟件提示ZEB2 mRNA的3'端的非翻譯區(3'UTR)的位點1303～1310 是miRNA-182的可能結合位點(BS)，體外合成含該位點的DNA片段及含該位點突變體的DNA片段，克隆至雙熒光素酶啟動子載體pMIR: pMIR-ZEB2-3'-UTR-wt和pMIR-ZEB2-3'-UTR-mut。將pMIR-ZEB2-3'-UTR-wt或pMIR-ZEB2-3'-UTR-mut 及miRNA-182共同轉染至肺癌細胞中，培養48 h后，用熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.7Western印跡等量提取細胞蛋白經8％～10％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸銨凝膠(SDS-PAGE)分離膠和5％濃縮膠分離后，半干轉印至硝酸纖維素膜上，以含5％ BSA的Tris鹽酸緩沖液(TBST)室溫封閉1 h，加入一抗4℃過夜孵育。第2天用0.1％ TBST洗膜3次，5 min/次，加入相應的HRP標記的二抗，室溫孵育1 h。0.1％ TBST洗膜后，硝酸纖維素膜以Supersignal West Femto HRP敏感化學發光底物對條帶進行顯色。β-actin作為內參對照。所有實驗至少重復3次。

1.8統計學方法應用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2　結果

2.1肺癌細胞和組織標本中miRNA-182表達情況四種具有不同轉移能力的肺癌細胞系miRNA-182表達高低不同，同轉移能力較弱的肺癌細胞系NL9980(0.36±0.03)或95C(0.19± 0.03)相比，具有高轉移能力的肺癌細胞系95D(0.05±0.02)和L9981(0.04±0.02)其miRNA-182 mRNA表達顯著下調(P＜0.05)。同時，與原發性肺癌組織(0.11±0.06)相比，淋巴結轉移癌組織中miRNA-182 mRNA表達亦顯著下調(P＜0.05)。

2.2miRNA-182表達與肺癌臨床病理特征的關系miRNA-182在肺癌組織的表達水平僅與患者有無淋巴結轉移密切相關(P＜0.05)，而與患者年齡、性別、是否吸煙和臨床分期均無明顯關系(P＞0.05)。見表1。

表1　miRNA-182表達量與肺癌組織臨床病理特征的關系

2.3miRNA-182對肺癌細胞轉移和侵襲的影響傷口愈合實驗顯示，與對照組相比，miRNA-182可顯著抑制肺癌細胞系95D和L9981的轉移(P＜0.05) (圖2A)。與對照組相比，轉染miRNA-182可顯著抑制肺癌細胞系95D和L9981的侵襲能力(P＜0.05)，而轉染miRNA-182抑制劑可增加肺癌細胞系95D 和L9981的侵襲能力(P＜0.05) (圖2B)。

圖1　miRNA-182對肺癌細胞轉移和侵襲的影響

2.4miRNA-182靶基因預測通過靶基因預測軟件尋找miRNA-182可能作用的靶基因，結果提示ZEB2可能為miRNA-182的功能性靶基因，且為感興趣的基因。miRNA-182預測結合的ZEB2 3'-UTR的靶位點見圖2。為確定miRNA-182是否和ZEB2間存在直接的相互作用，構建了含野生型和突變型ZEB2 的3'-UTR序列的pMIR載體。結果顯示，與對照組(1.01± 0.13)相比，共轉染野生型pMIR-ZEB2 3'-UTR載體和miRNA-182，熒光素酶活性(0.57±0.04)顯著降低(P＜0.05) ;與對照組(1.02±0.2)相比，共轉染突變型pMIR-ZEB2 3'-UTR載體和miRNA-182的熒光素酶活性(1.12±0.16)未出現顯著性改變(P＞0.05)。

圖2　miRNA-182靶基因預測及驗證

2.5miRNA-182對肺癌細胞ZEB2表達的影響miRNA-182 miRNA-182可顯著抑制肺癌細胞系95D和L9981中ZEB2的表達，上調與上皮-間質轉化(EMT)相關E-cadherin表達，并下調EMT相關Vimentin的表達。見圖3。

圖3　Western印跡檢測miRNA-182對肺癌細胞中EMT相關蛋白表達的影響

3　討論

miRNA是一類小的，非編碼RNAs，長度約為19～25個核苷酸。近年來，許多研究表明miRNA在人類癌癥的發生發展中具有重要的作用。然而關于miRNA-182在肺癌發生發展中的作用及相關機制尚未研究清楚。關于miRNA-182在惡性腫瘤中表達及作用的文獻報道還很少，且存在矛盾之處。Moskwa等〔5〕的研究證實，在惡性度較高的乳腺癌細胞中miRNA-182的表達顯著低于惡性度較低的乳腺癌細胞;結果與Patryk等的研究結果基本一致。其他文獻報道〔6〕，高表達miRNA-182的ER+乳腺癌患者，其對內分泌治療敏感，無復發，生存期長，且miRNA-182與淋巴結轉移呈負相關，結果與文獻報道一致。然而也有文獻報道〔7～9〕，在結直腸癌、前列腺癌、卵巢癌等癌組織中miRNA-182表達顯著上調。這可能是由于miRNA-182在不同的腫瘤組織中其調控的靶基因不盡相同，而其下游靶基因的生物學效應決定了miRNA-182的作用〔10〕。同時，實驗樣本的選取和實驗方法的不同也可能會造成結果的不一致。

正因為miRNAs下游靶基因的生物學效應決定了miRNAs的作用。本研究通過靶基因預測軟件聯合篩選出miRNA-182的靶基因，在眾多靶基因中，因ZEB2在人類癌癥的發生發展中具有重要的作用，而成為我們感興趣的靶基因。ZEB2已證實在多種癌癥的發展中發揮著重要的作用，如胃癌，卵巢癌，鱗狀細胞癌和非小細胞肺癌〔11〕。在EMT過程中，ZEB2通過結合于E-鈣黏蛋白啟動子區的CACCT(G)基序而特異性地抑制E-鈣粘蛋白的表達〔12〕。本研究結果提示miRNA-182可能是通過調節ZEB2的表達而抑制肺癌細胞的轉移和侵襲能力。EMT過程是腫瘤轉移的主要機制。腫瘤細胞從原發灶穿透基底膜而轉移至血液循環，這一過程包括了上皮特異性E-鈣黏蛋白和間質標志物波形蛋白的重新分布。

綜上，miRNA-182可能是一類新的腫瘤抑制miRNA。miRNA-182可通過調節EMT相關ZEB2而抑制肺癌的轉移和侵襲，為肺癌的發生發展提供了一種新的見解。此外，在肺癌治療中，miRNA-182可作為一種潛在的治療靶點。

4　參考文獻

1魯艷明，銀鐸，王寧，等.miRNA-200c對卵巢癌細胞侵襲能力影響觀察〔J〕．中華腫瘤防治雜志，2014; 21(10) : 732-5.

2王球玉，唐珺，周欣想，等.miR-129在乳腺癌中表達下調及其對乳腺癌細胞遷移運動的影響〔J〕．生理學報，2012; 64(4) : 403-11．

3Lin Y，Wu J，Chen H，et al．Cyclin-dependent kinase 4 is a novel target in micoRNA-195-mediated cell cycle arrest in bladder cancer cells〔J〕．FEBS Lett，2012; 586(4) : 442-7.

4Liu S，Li L，Zhang Y，et al．The oncoprotein HBXIP uses two pathways to up-regulate S100A4 in promotion of growth and migration of breast cancer cells〔J〕．J Biol Chem，2012; 287(36) : 30228-39.

5Moskwa P，Buffa FM，Pan Y，et al．miR-182-mediated downregulation of BRCA1 impacts DNA repair and sensitivity to PARP inhibitors〔J〕．Mol Cell，2011; 41(2) : 210-20.

6Rodríguez-González FG，Sieuwerts AM，Smid M，et al．MicroRNA-30c expression level is an independent predictor of clinical benefit of endocrine therapy in advanced eatrogen receptor positive breast cancer〔J〕．Breast Cancer Res Treat，2011; 127(1) : 43-51.

7Sarver AL，French AJ，Borralho PM，et al．Human colon cancer profiles show differential microRNA expression depending on mismatch repair status and are characteristic of undifferentiated proliferative states〔J〕．BMC Cancer，2009; 9: 401.

8Schaefer A，Jung M，Mollenkopf HJ，et al．Diagnostic and prognostic implications of micro RNA profiling in prostate carcinoma〔J〕．Int J Cancer，2010; 126(5) : 1166-76.

9Nagaraja AK，Creighton CJ，Yu Z，et al．A link between mir-100 and FRAP1/mTOR in clear cell ovarian cancer〔J〕．Mol Endocrinol，2010; 24 (2) : 447-63.

10李謙平.miR-16-1抑制A549細胞株生物學行為及非小細胞肺癌ARID1A基因表達的研究〔D〕.上海:華中科技大學，2012: 27-9.

11Gemmill RM，Roche J，Potiron VA，et al．ZEB1-responsive genes in nonsmall cell lung cancer〔J〕．Cancer Lett，2011; 300(1) : 66-78.

12Comijn J，Berx G，Vermassen P，et al．The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates Ecadherin and induces invasion 〔J〕．Mol Cell，2001; 7(6) : 1267-78.

〔2015-03-19修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者:朱佳龍(1968-)，男，碩士，主任醫師，主要從事心胸外科相關疾病。

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 15-4182-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.15.032