凍融卵母細(xì)胞顯微受精后凍融胚胎移植成功妊娠一例華

?

凍融卵母細(xì)胞顯微受精后凍融胚胎移植成功妊娠一例華

徐清華，張敏，常秀峰，李冬秀，包莉莉，許鵬宇，于曉惠，吳小

[作者單位]050082 石家莊，解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心

[關(guān)鍵詞]低溫保存；卵母細(xì)胞；胚胎移植；妊娠

隨著輔助生殖技術(shù)發(fā)展，卵子冷凍應(yīng)被視為輔助生殖技術(shù)重要的組成部分[1]。2013年美國(guó)生育年會(huì)頒布的指導(dǎo)原則表明，目前成熟卵子的冷凍已不再局限于實(shí)驗(yàn)研究[2]。解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心采用玻璃化冷凍胚胎取得了滿意的種植率和妊娠率。2014年該中心采用玻璃化冷凍經(jīng)歷了凍卵、凍胚的雙凍試管嬰兒1例，獲得臨床妊娠，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1臨床資料女，23歲。主因婚后1年不孕于2014年1月17日就診。患者月經(jīng)規(guī)律，性生活正常，未避孕，同居1年未孕。女方B超監(jiān)測(cè)有排卵，未行輸卵管檢查。男方精液常規(guī)分析結(jié)果：密度2.77×106/ml，d級(jí)(不活動(dòng))精子：100%。男方口服中藥數(shù)月，期間服用氯米芬+左卡尼丁2個(gè)月，經(jīng)治療后精液分析結(jié)果：密度8.61×106/ml，a級(jí)0，b級(jí)0.83%，c級(jí)1.65%。雙方否認(rèn)肝炎、結(jié)核及性病史，染色體檢查均正常。診斷：原發(fā)不孕、重度少弱精子癥。擬行卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)(ICSI)助孕。女方用達(dá)英-35預(yù)處理1個(gè)月，采用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)長(zhǎng)方案降調(diào)，用促卵泡激素(FSH)聯(lián)合人絨毛膜促性腺激素(HCG)促排卵。2014年2月28日取得卵子33枚，成熟卵母細(xì)胞(MⅡ)29枚，取卵當(dāng)天只找到男方3條活精子用于ICSI注射，其中2枚卵子異常受精，1枚卵子第3天卵裂2個(gè)細(xì)胞，未移植。其余卵子均冷凍。

1.2卵子凍融及復(fù)蘇方法采用玻璃化冷凍，主要試劑為乙二醇、二甲基亞砜和蔗糖，平衡液濃度7.5%乙二醇+7.5%二甲基亞砜，冷凍液濃度15%乙二醇+15%二甲基亞砜+0.5 mol/L蔗糖，4℃保存。使用前取出放置室溫。將卵子放入平衡液中，時(shí)間≤5 min，取出卵子放入冷凍液中，25～60 s將卵子轉(zhuǎn)移到冷凍環(huán)迅速放入液氮。卵子復(fù)蘇液主要為蔗糖，復(fù)蘇液1、2、3濃度分別為1.00、0.50、0.25 mol/L，4℃保存。使用前在37℃平衡，卵子從液氮中取出迅速放置復(fù)蘇液1中，放置時(shí)間為1 min，然后轉(zhuǎn)入復(fù)蘇液2中5 min，在復(fù)蘇液3中洗滌，最后放入體外培養(yǎng)液中。

1.3胚胎凍融及移植方法2014年8月19日解凍卵子9枚，其中8枚MⅡ，1枚死亡，復(fù)蘇率為88.9%。男方當(dāng)天留取精液，找到8條活精子行ICSI注射，受精率為100.0%，雙原核(2PN)率為87.5%，多核1枚。第3天卵裂率為100.0%，有5枚可利用胚胎，因女方身體突然不適取消移植，將5枚胚胎全部冷凍，其余2枚繼續(xù)培養(yǎng)，第5天退化丟棄。2014年9月13日行凍融胚胎復(fù)蘇移植2枚，胚胎分別為8細(xì)胞2級(jí)(8C2)和12細(xì)胞3級(jí)(12C3)。

2結(jié)果

本例凍融胚胎復(fù)蘇移植后14 d，血HCG 1270 mU/ml，黃體酮28 ng/ml，雌二醇(E2)408 pg/ml，取得生化妊娠。移植30 d行B超監(jiān)測(cè)宮內(nèi)可見(jiàn)27 mm×15 mm孕囊，內(nèi)見(jiàn)胎芽、卵黃囊及原始心血管搏動(dòng)(圖1)，目前胎兒宮內(nèi)發(fā)育正常。

圖1凍融胚胎復(fù)蘇移植30 d B超影像

3討論

在冷凍技術(shù)中，凍精、凍胚胎技術(shù)在生殖領(lǐng)域已相當(dāng)成熟，但是凍融人卵細(xì)胞一直是生殖技術(shù)的一項(xiàng)難關(guān)。自1986年首次報(bào)道人卵子冷凍-復(fù)蘇并成功受孕以來(lái)[3]，卵子冷凍技術(shù)進(jìn)展較為緩慢，主要由于人卵母細(xì)胞是體內(nèi)最大的細(xì)胞，內(nèi)含大量水分，加之體表比例大和胞膜滲透性等特性，在低溫冷凍、復(fù)溫過(guò)程中容易形成冰晶，導(dǎo)致紡錘體受損造成細(xì)胞致命的損傷[4-5],因此選擇合適的冷凍方法減少冰晶形成至關(guān)重要。

近年來(lái)，玻璃化冷凍是一種新興的冷凍技術(shù),該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，不需要昂貴的冷凍儀器，而且很好地解決了冷凍、復(fù)溫時(shí)冰晶造成的損傷，是目前胚胎冷凍最有效的方法[6-7]。其基本原理是利用高濃度的滲透性冷凍保護(hù)劑(如乙二醇、二甲基亞砜、聚乙二醇等)和非滲透性保護(hù)劑蔗糖，經(jīng)急速降溫使脫水后樣本殘留的水分由液態(tài)轉(zhuǎn)化為類(lèi)似玻璃的非晶體化狀態(tài)，在-196℃的低溫環(huán)境中將細(xì)胞或組織固定在玻璃化狀態(tài)，保留了細(xì)胞內(nèi)外液體正常的分子和離子分布，避免產(chǎn)生冷凍損傷[8]。Trokoudes等[9]用玻璃化冷凍保存的卵子供卵，卵子復(fù)蘇率為91.4%，新鮮卵子和冷凍卵子受精率分別為86.6%和84.4%，卵裂率分別為95.8%和95.1%，高質(zhì)量胚胎率分別為64.9%和60.4%，種植率分別為24.7%和25.6%，活產(chǎn)率分別為47.2%和41.5%，兩者之間無(wú)明顯差異，提示冷凍卵子可以得到與新鮮卵子一樣質(zhì)量的胚胎、妊娠率和種植率。Solé等[10]報(bào)道玻璃化冷凍卵子供卵復(fù)蘇率為85.6%，新鮮卵子和冷凍卵子受精率分別為80.7%和78.2%，妊娠率分別為71.0%和68.2%，高質(zhì)量胚胎率分別為54.1%和49.8%，多胎妊娠率分別為27.7%和20.8%，活產(chǎn)率分別為38.4%和43.4%。Trokoudes等[9]和Solé等[10]的研究結(jié)果一致，認(rèn)為玻璃化冷凍是保存卵子的一個(gè)有效方法。

本例采用玻璃化冷凍卵子復(fù)蘇率為88.9%，受精率為100.0%，卵裂率為100.0%，達(dá)到與新鮮卵子一致的效果。Levi Setti等[11]報(bào)道了世界首例冷凍精子、冷凍卵子和冷凍胚胎的“三凍”試管嬰兒誕生。2006年國(guó)內(nèi)首例“三凍”試管嬰兒誕生[12]。繼2014年倪豐等[13]報(bào)道的1例凍卵凍胚試管嬰兒誕生后，本例凍卵、凍胚試管嬰兒成功臨床妊娠，這些病例為MⅡ和胚胎多次冷凍提供了臨床資料和經(jīng)驗(yàn)，為年輕女性保存生育能力以及建立卵子庫(kù)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Gook D A. History of oocyte cryopreservation[J].Reprod Biomed Online， 2011，23(3):281-289.

[2]Practice Committees of American Society for Reproductive Medicine， Society for Assisted Reproductive Technology. Mature oocyte cryopreservation: a guideline[J].Fertil Steril， 2013，99(1):37-43.

[3]Chen C. Pregnancy after human oocyte cryopreservation[J].Lancet, 1986,1(8486):884-886.

[4]Shaw J M, Oranratnachai A, Trounson A O. Fundamental cryobiology of mammalian oocytes and ovarian tissue[J].Theriogenology， 2000，53(1):59-72.

[5]Baka S G, Toth T L, Veeck L L,etal. Evaluat ion of the spindle apparatus of in-vitro matured human oocytes following cryopreservation[J].Hum Reprod， 1995，10(7):1816-1820.

[6]Cobo A, Diaz C. Clinical application of oocyte vitrification: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J].Fertil Steril, 2011,96(2):277-285.

[7]Nagy Z P, Chang C C, Shapiro D B,etal. Clinical evaluation of the efficiency of an oocyte donation program using egg cryo-banking[J].Fertil Steril, 2009,92(2):520-526.

[8]Mukaida T, Oka C. Vitrification of oocytes, embryos and blastocysts[J].Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 2012,26(6):789-803.

[9]Trokoudes K M, Pavlides C, Zhang X. Comparison outcome of fresh and vitrified donor oocytes in an egg-sharing donation program[J].Fertil Steril, 2011,95(6):1996-2000.

[10]Solé M, Santaló J, Boada M,etal. How does vitrification affect oocyte viability in oocyte donation cycles? A prospective study to compare outcomes achieved with fresh versus vitrified sibling oocytes[J].Hum Reprod, 2013,28(8):2087-2092.

[11]Levi Setti P E, Albani E, Novara P V,etal. Normal birth after transfer of cryopreserved human embryos generated by microinjection of cryopreserved testicular spermatozoa into cryopreserved human oocytes[J].Fertil Steril, 2005,83(4):1041.

[12]陳貴安,蔡學(xué)泳,廉穎,等.玻璃化冷凍成熟卵母細(xì)胞經(jīng)解凍精液?jiǎn)尉幼⑸涫芫⑴咛鋈诩耙浦踩焉锍晒J].中華婦產(chǎn)科雜志,2006,41(4):217-218.

[13]倪豐,汪存利,姜宏,等.凍融卵母細(xì)胞顯微授精后凍融胚胎移植成功并分娩一例報(bào)道[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志,2014,23(8):676-678.

(收稿時(shí)間：2015-02-28修回時(shí)間：2015-03-18)

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.05.006

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中國(guó)圖書(shū)資料分類(lèi)號(hào)]R711.6B

[文章編號(hào)]2095-140X(2015)05-0021-02

[通訊作者]吳小華,E-mail：xiaohuawu65@sohu.com

[基金項(xiàng)目]河北省計(jì)劃生育委員會(huì)科研基金項(xiàng)目(2012-C02)