細胞穿透肽PEP-1介導血紅素加氧酶1預處理對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用*

王衛(wèi)星 師貞宗 陳先祥

細胞穿透肽PEP-1介導血紅素加氧酶1預處理對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用*

王衛(wèi)星1師貞宗1陳先祥2，#

目的：探討細胞穿透肽PEP-1介導的血紅素加氧酶-1(HO-1)對大鼠肝臟缺血再灌注損傷(HIRI)的保護作用。方法：(1)用基因工程學方法人工合成融合蛋白PEP-1-HO-1。(2)選擇雄性SD大鼠,隨機分為三組(n均=8)：假手術組(S組)只開腹，不予干預。HIRI模型組(HIRI組)，采用夾閉肝動脈和門靜脈30min后恢復血流；HIRI+PEP-1-HO-1預處理組(HIRI+HO-1組)，夾閉肝動脈和門靜脈前經(jīng)門靜脈注射PEP-1-HO-1蛋白1mg，其余處理同HIRI組。(3)實驗完成后，取三組大鼠下腔靜脈血，采用自動生化分析儀測定血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)、總膽紅素(TBIL)等肝功能指標。處死大鼠,取部分肝臟進行組織切片、HE染色，觀察各組肝組織病理學變化。結果：成功制備高純度PEP-1-HO-1融合蛋白。HIRI組大鼠各項肝功能指標均顯著高于S組(P<0.01), HIRI+HO-1組各項肝功能指標值明顯低于HIRI組(P<0.01)，但仍高于S組(P<0.05)。HIRI組肝細胞腫大或呈球形，胞漿疏松水樣變或完全透明，伴炎細胞浸潤，可見片狀壞死。HIRI+HO-1組肝臟損傷程度較HIRI組明顯改善，炎性細胞浸潤及肝細胞壞死程度明顯減輕，但與 S組比較，肝臟組織損傷仍明顯。結論：用細胞穿透肽PEP-1介導HO-1預處理能有效保護肝細胞，明顯減輕肝功能損害。

細胞穿透肽PEP-1；血紅素加氧酶1；肝臟缺血再灌注損傷；大鼠

肝臟移植術已成為終末期肝病的最佳治療手段，但手術過程中的缺血再灌注(IR)造成的肝臟損傷比較突出，成為亟待解決的重要課題。目前已有研究[1]顯示血紅素加氧酶1(HO-1)可在肝臟缺血再灌注損傷(HIRI)中起重要作用，能明顯減輕HIRI、并能延長移植器官保存時限。本實驗采用分子生物學方法，用人HO-1cDNA質粒與細胞穿透酶PEP-1連接形成的活性PEP-1-HO-1融合蛋白預處理HIRI大鼠，結果顯示其有明顯改善肝功能和減輕肝組織損傷的功效，且目的蛋白劑量易于控制，應用時限易于掌握。結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

臺式高速冷凍離心機(Hettich，Universal 32R，德國)，超速冷凍離心機(HITACHI himac CP80MX，日本)，倒置顯微鏡(Nikon，日本)，水浴恒溫搖床(SHY-2，中國江蘇)，全自動生化分析儀(HITACHI，日本)；異丙基硫化-β-D-半乳糖苷(IPTG，美國Promega公司)，Ni2+-NTA-樹脂(美國Qigen公司)，PEP-1肽DNA序列(KETWWETWWETWSQPKKKRKV)由北京賽百盛基因技術有限公司合成，大腸桿菌Rosetta(DE3)pLysS為湖北醫(yī)藥學院臨床研究所贈送，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 PEP-1-HO-1融合蛋白的制備

按照顏學韜等[2]的方法制備融合蛋白PEP-1-HO-1。將構建的原核表達質粒pET15b-PEP-1-HO-1轉化感受態(tài)宿主菌大腸桿菌Rosetta(DE3)pLysS,用IPTG誘導表達PEP-1-HO-1靶蛋白,采用Ni2+-NTA對其純化，取純化后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳,將樣品蛋白轉移到NC膜上,用抗His-tag抗體孵育,采用Western Blotting顯示分析。以牛血清白蛋白(BSA,1mg/ml)進行標準對照,采用Bradford法進行蛋白濃度測定，獲得穩(wěn)定表達純度的PEP-1-HO-1融合蛋白溶液，分裝后存放于冰箱(-21℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗動物及分組處理

24只SD雄性大鼠(湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心購進)，體重220-250g。采用隨機數(shù)字表法分為三組，每組8只，術前禁食12h，自由飲水。(1)假手術組(S組)：只開腹，不予干預；(2)HIRI模型組(HIRI組)：參照Yamada等[4]的方法，將實驗動物乙醚吸入麻醉后開腹，腹腔內滴10%水合氯醛1ml補充麻醉，分離暴露第一肝門見肝動脈、門靜脈及膽總管，用無損傷血管夾夾閉肝動脈及門靜脈(不夾膽管),30min后恢復血流灌注；(3)HIRI+PEP-1-HO-1預處理(HIRI+HO-1組)：夾閉肝動脈和門靜脈前，每只大鼠均經(jīng)門靜脈一次性注入PEP-1-HO-1融合蛋白1mg,其余操作同HIRI組。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 血液學檢測：各組大鼠均在實驗完成后經(jīng)下腔靜脈取血5ml，加入含肝素抗凝管中，常溫下1 500r/min離心5min，取血清4℃保存。由本院生化室主管技師按常規(guī)操作測定谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)、總膽紅素(TBIL)等肝功能指標水平。

1.4.2 組織病理學檢測：下腔靜脈取血后斷頭處死大鼠，立即取肝左葉部分組織置于40g/L多聚甲醛液中固定，石蠟包埋，連續(xù)切片(5μm)，常規(guī)HE染色，顯微鏡觀察各組肝臟組織病理變化。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 融合蛋白PEP-1-HO-1的檢測及純度

電泳凝膠用考馬斯亮藍R-250染色。結果顯示，在分子量35KD處見一明顯條帶，即融合蛋白PEP-1-HO-1(圖1)。經(jīng)Bradford法測定PEP-1-HO-1融合蛋白濃度為1.6mg/ml。

圖1 SDS-PAGE電泳圖

A，純化前PEP-1-HO-1蛋白(峰值)；B，純化前PEP-1-HO-1蛋白(均值)；C，純化后PEP-1-HO-1蛋白

2.2 各組肝功能指標比較

三組肝功能指標間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較表明，HIRI組和HIRI-HO-1組各項指標測定值均顯著高于S組(t值均>3.016，P<0.05或P<0.01)，但HIRI+HO-1組顯著低于HIRI組(t值均>5.378，P均<0.05)。見表1。

表1 各組肝功能指標均=8)

注：與S組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與HIRI組比較，3)P<0.05

2.3 各組肝臟組織學變化

大體觀察：S組大鼠肝臟表面顏色紅潤，色澤均勻，富有彈性；HIRI組肝臟缺血30min后，肝臟明顯蒼白，但仍有彈性；恢復灌注瞬間，缺血肝組織立即呈暗紅色，且色澤均勻，再灌注后肝葉表現(xiàn)為表面小葉灌注不良，呈散在小葉狀分布。HIRI+HO-1組大鼠肝臟顏色仍較紅潤，色澤大體均勻，彈性較好，散在少許點狀蒼白。

顯微觀察：S組肝臟組織結構清晰，小葉中央靜脈、肝細胞索、肝竇、匯管區(qū)結構清晰，無明顯炎性細胞浸潤。HIRI組大鼠恢復灌注后缺血肝葉組織呈現(xiàn)肝細胞腫大，胞漿疏松呈網(wǎng)狀、半透明呈水樣變性或肝細胞脹大呈球形，胞漿幾乎完全透明，呈氣球樣變，伴大量嗜酸性小體形成及嗜酸性壞死或灶狀或片狀壞死，且伴明顯炎性細胞浸潤。HIRI+HO-1組較HIRI明顯改善，但仍見肝細胞部分氣球樣變、肝索紊亂；少量嗜酸性小體形成及嗜酸性壞死或點狀壞死或片狀壞死，且伴少量炎性細胞浸潤。見圖2。

[本文圖2見封3]

3 討 論

HIRI是影響肝臟外科手術，尤其肝移植存活率和遠期療效的重要因素之一。因其不僅可以引起超急性排斥期移植器官功能障礙，而且可以增加急性和慢性排斥反應的發(fā)生[5]。氧自由基、中性粒細胞及內皮細胞的激活在HIRI中起著十分重要的作用[6，7]。如何應對HIRI成為目前研究的熱點，HO-1作為保護性蛋白也愈來愈受到關注。

臨床研究[8]顯示，HO-1在肝、肺、腎等血管比較豐富的臟器組織IRI中表達顯著增強，對IRI有明顯保護作用。動物實驗發(fā)現(xiàn)HO-1的表達上調在許多動物移植模型中具有減輕移植物IRI和排斥反應的作用，表現(xiàn)為多形核中性粒細胞、T淋巴細胞、巨噬細胞浸潤明顯減輕，促炎因子如白細胞介素1(IL-1)、IL-6、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)及巨噬細胞炎性蛋白2(MIP-2)水平顯著下降，而且HO-1高表達還可以抑制內皮細胞凋亡，增加局部血液灌注量，改善微循環(huán)障礙[9]，從而明顯延長移植器官的存活時間。進一步研究[10]表明，應用細胞穿透肽PEP-1轉導HO-1進入人肝細胞株LO2，對缺氧復氧模型的肝細胞有良好保護作用，并且其效果與融合蛋白PEP-1-HO-1有一定的濃度及時間依賴關系。通過不同方法建立HIRI模型后，用腺相關病毒介導HO-1進入動物體內，對HIRI也有改善作用[11]。本實驗成功復制HIRI模型，并采用細胞穿透肽PEP-1作為分子載體，將有活性的融合蛋白PEP-1-HO-1成功轉導進入肝細胞，有效地改善了HIRI后肝功能和肝組織損害。與上述研究結果相一致。

天然有活性的HO-1在生物體內沒有特異性通道或介質進入細胞內，需要一種介質導入細胞才能發(fā)揮作用。既往研究中，有人利用腺病毒作為載體轉染HO-1基因的方法進行大鼠HIRI的干預研究，獲得一定效果，但該方法存在基因導入率低，導入可控性差，安全性不確定等不足之處[11]，從而限制了該方法的應用。本文選擇安全、高效、無毒的PEP-1[12]作為轉導介質，運用生物工程學方法將人HO-1的cDNA與介質質粒pET-15PEP-1-HO-1鏈接，然后轉入宿主菌大腸桿菌Rosetta內，成功高效表達具有天然活性PEP-1-HO-1蛋白，并在上述動物實驗中顯示出良好的抗HIRI作用。其機制可能是HO-1能控制細胞內自由鐵水平，降解膽色素，釋放一氧化碳(CO)，進而表現(xiàn)出抗氧化、維持肝細胞微循環(huán)穩(wěn)定，抗凋亡、抑制增殖，抗炎與免疫調節(jié)等作用[13]。

總之，HIRI是一個復雜的過程，涉及多個細胞類型和多種氧化應激反應。通過對肝臟進行預處理，或通過使用新的抗氧化劑防止氧化應激反應，或許是很有前景的治療策略。HO-1及其它的應用研究對這一策略的實現(xiàn)有重要意義。今后尚需加強HO-1的作用機制，尤其是分子機制的深入研究，為臨床應用提供可靠的理論依據(jù)。

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本文第一作者簡介：

王衛(wèi)星(1960—)，男，漢族，醫(yī)學博士，主任醫(yī)師、教授、博士生導師。 主要從事肝膽胰腺外科、微創(chuàng)外科及臨床靜脈營養(yǎng)的研究，并致力于胰腺癌和胰腺炎的基礎研究

1KerrJF，WyllieAM，CurrieAR.Apoptosis:basicbiologicalphenomenonwithwide-rangingimplicationsintissuekinetics[J].BRJCancer，2012，26(4)：239-257.

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4YamadaF,SaitoT,AbeT,etal．Ischemicpreconditioningenhancesregenerativecapacityofhepatocytesinlong-termiscbemicallydamagedratlivers[J].GastroenterolHepatol，2011,22(11):1 971-1 977．

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Cell Penetrating Peptides PEP-1 Mediated Heme Oxygenase 1 Pretreatment on the Protection of Hepar Ischemia-reperfusion Injury in Rats

WANG Wei-xing1,SHI Zhen-zong1,CHEN Xian-xiang2,#

1Department of General Surgery,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China;2Department of General Surgery,Renmin Hospital of Shiyan City Affiliated Hubei Medical College,Shiyan 442000,China;#

Objective: To study liver protection of PEP-1 mediated heme oxygenase 1(HO-1) in rat hepar ischemia-reperfusion injury(HIRI). Method: (1)Synthetic protein (PEP-1-HO-1) was made by genetic engineering methods. (2)24 male SD rats were randomly assigned to three groups:the sham group(S group), HIRI model group(HIRI group), HIRI and PEP-1-HO-1 pretreatment group(HIRI+HO-1 group).(3) After experiment completely，extraction of three groups of inferior vena venous blood of rats by automatic biochemical analyzer determine serum：cereal third transominase (ALT), aspertate aminotransferase (AST), gamma glutamyl transpeptidase(γ-GT), total bilirubin (TBIL) and liver function indicators.Taking part executed in rats after the liver biopsy HE staining,each group liver tissue pathological changes were observed. Results: Successful preparation of high purity PEP-1-HO-1 fusion protein. Rats liver function index HIRI group were significantly higher than S group (P<0.01),HIRI+ HO-1 set of various liver function index was lower than that in group HIRI (P<0.01),but it was still higher than the group S (P<0.05).HIRI+HO-1 set of HIRI group significantly reduced degree of liver injury, inflammatory cell infiltration and necrosis of liver cells was significantly reduced，but compared with the group S ，the liver tissue damage was still obvious.Conclusion: It can pretreatment effectively protect the liver cells with cell penetrating peptides PEP-1 mediated heme oxygenase 1，significantly reduce liver damage.

PEP-1;HO-1；Hepar ischemia-reperfusion injury；Rat

湖北省教育廳科學技術研究計劃重點項目(編號D20082045)

1武漢大學人民醫(yī)院普外科，武漢 430060；2湖北醫(yī)藥學院附屬十堰市人民醫(yī)院普外科，十堰 442000；#

，E-mail：chenxian881@hotmail.com

本文2014-11-08收到，2014-12-28修回

R575

A

1005-1740(2015)01-0014-04