日本血吸蟲腺苷酸激酶-1與程序性細胞死亡蛋白-10基因的克隆表達及其在發育中表達的變化*

高彥茹 熊 濤 黃文鈴 趙琴平 明珍平 鐘沁萍 蔣明森 董惠芬

武漢大學基礎醫學院人體寄生蟲學教研室，武漢 430071；#通訊作者

日本血吸蟲腺苷酸激酶-1與程序性細胞死亡蛋白-10基因的克隆表達及其在發育中表達的變化*

高彥茹 熊 濤 黃文鈴 趙琴平 明珍平 鐘沁萍 蔣明森 董惠芬#

武漢大學基礎醫學院人體寄生蟲學教研室，武漢 430071；#通訊作者

目的：克隆、表達、定位日本血吸蟲腺苷酸激酶-1(Schistosoma Japonicum Adenylate Kinase-1，SjAK1)及日本血吸蟲程序性細胞死亡蛋白-10(Schistosoma Japonicum Programmed Cell Death-10，SjPCD10)，為進一步研究其基因在生長發育中的功能奠定基礎。方法：據SjAK1、SjPCD10基因完整開放閱讀框(長度分別為594bp、651bp)分別設計并合成特異性引物，提取日本血吸蟲成蟲總RNA，RT-PCR獲得cDNA，以cDNA為模板分別擴增SjAK1、SjPCD10目的基因片段，與載體pET28a質粒共同進行雙酶切，連接、轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆并測序鑒定后，抽提重組質粒，轉化表達宿主菌BL21。PCR鑒定陽性重組克隆，IPTG誘導表達，SDS-PAGE、Western Bloting檢測表達結果，鎳柱親和層析純化目的蛋白，BCA法定量目的蛋白；ATP熒光檢測試劑盒檢測重組SjAK1的活性。將目的蛋白分別免疫新西蘭兔制備多抗，ELISA鑒定多抗效價。免疫組化法檢測SjAK1和SjPCD10基因在日本血吸蟲皮膚型童蟲(30min)、肺型童蟲(3天)、肝門型童蟲(10天、14天、18天、22天)以及成蟲(26天)中表達的變化。結果：成功構建重組表達質粒pET28- SjAK1和pET28- SjPCD10，原核表達的目的蛋白rSjAK1為可溶性、rSjPCD10呈包涵體形式；SDS-PAGE鑒定目的蛋白rSjAK1約26kDa、rSjPCD10約28kDa，與理論分子量一致；經鎳柱親和層析純化獲得高純度目的蛋白，rSjAK1的比酶活為135.2U/mg。將目的蛋白免疫新西蘭兔后血清效價均高于1∶1 280。免疫組化結果顯示，SjAK1在各型童蟲均有表達，皮膚型和肺型童蟲中表達較少，肝門型童蟲感染10天開始增加，但成蟲期表達又減少；SjPCD10從18天開始表達增多，在雄蟲和蟲卵表達最為明顯。結論：本實驗成功克隆表達及純化SjAK1、SjPCD10，其基因在日本血吸蟲發育過程中均有表達，為深入研究其基因功能奠定了基礎。

日本血吸蟲；腺苷酸激酶；程序性細胞死亡蛋白；克隆表達；蟲體發育

國家自然科學基金(No.81273010)