膠質母細胞瘤患者血漿miRNA表達譜研究

汪志強　王輝云　鄧美玲　吳少雄

作者單位:510060 廣州市中山大學腫瘤防治中心

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·基礎研究·

膠質母細胞瘤患者血漿miRNA表達譜研究

汪志強王輝云鄧美玲吳少雄

作者單位:510060 廣州市中山大學腫瘤防治中心

【摘要】目的采用microRNA(miRNA) 基因芯片分析在膠質母細胞瘤(GBM)患者血漿中表達的miRNA，尋找GBM血液中的分子生物學標志物。方法分別收集22例GBM患者和8例健康志愿者血液標本，試劑盒提取總RNA，與基因芯片進行雜交，檢測GBM患者和健康志愿者血漿中miRNA表達譜，篩選差異表達的miRNA。采用Kaplan-Meier方法分析差異表達的miRNA與GBM生存期的關系。結果miRNA表達譜分析發現在GBM差異表達的miRNA共19個，其中上調3個，下調16個。生存分析顯示，miR-30c-2-3p高表達組患者中位無疾病進展時間較低表達組明顯縮短(P=0.016)。結論通過基因芯片的方法發現了在GBM患者血漿中19個差異表達的miRNA。miR-30c-2-3p的高表達與GBM的不良相關，可能是潛在的GBM預后預測分子標記物。

【關鍵詞】膠質母細胞瘤；血漿；微RNA；基因芯片

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:475～478)

近年來，顱內膠質瘤發病率逐年遞增。國內報道膠質瘤約占全部腦腫瘤的35%～60%[1]。其中，原發性惡性(WHO Ⅲ、Ⅳ級)膠質瘤占35%～60%，以膠質母細胞瘤(glioblastoma,GBM)最常見。GBM屬高度惡性腫瘤，生長呈浸潤性，無明顯邊界，手術難以徹底切除，預后很差。即使給予積極治療，50%的患者在診斷后1年內死于腫瘤復發[2-4]。因此，找到能夠早期診斷、預測預后生物學標記物尤為重要。

microRNA(miRNA)是1類內源性的具有調控功能的小分子、單鏈非編碼RNA，在細胞代謝、分化、增殖和凋亡等生物學過程中發揮著重要的調控作用。研究表明miRNA在惡性腫瘤發生發展中起著重要的作用。此外，miRNA在體液(血漿/血清等)中能穩定的存在，而且部分體液miRNA具有腫瘤特異性和預后價值，使其可能成為潛在的非侵入性腫瘤標志物[5]。早期在腦膠質瘤的miRNA表達譜研究多基于組織學或細胞系展開的[6-7]，miRNA在血液或腦脊液的研究鮮有報道。本研究通過采用基因芯片的方法檢測在GBM患者血漿的miRNA，篩選差異表達的miRNA，尋找能夠早期診斷和預測預后的無創性分子生物學指標，為進一步探索GBM發生發展的可能機制提供線索。

1材料與方法

1.1病例與臨床資料的收集

收集中山大學附屬腫瘤醫院2010年10月-2014年3月收治的經病理檢查確診的22例GBM患者和8例健康志愿者的靜脈血液標本。GBM患者年齡29～76歲，平均50.7歲，其中男性8例,女性14例。健康志愿者年齡36～55歲，平均48歲，男性3例，女性5例；所有血液標本均為EDTA抗凝管空腹采集，1～2 h內離心分離獲得血漿轉入-80 ℃保存備用。所有患者和志愿者均簽署知情同意書。

1.2RNA的提取

按照Norgen’s Plasma/Serum Circulating RNA Purification 試劑盒(Norgen Biotek公司)說明書步驟抽提血漿總RNA，Nanodrop ND-1000微量紫外分光光度計測定總RNA濃度。

1.3MiRNA芯片制備

根據miRNA數據庫18.0選取1 849個miRNA設計高靈敏高特異性互補靶RNA結合的探針，使用芯片點樣儀SmarArrayerTM136(CapitalBio公司)點制miRNA芯片。

1.4熒光標記連接與芯片雜交

取0.3 μg總RNA，堿性磷酸酶去磷酸化，二甲基亞砜(DMSO)變性，T4 RNA連接酶標記Dy 547(Dharmacon公司)。采用Micro Bio-Spin 6 column (BioRad公司)純化濾過并濃縮成粉，溶于雜交液中，加入微陣列中，46 ℃雜交過夜。

1.5清洗芯片、信號數字化處理

雜交結束后進行芯片清洗。芯片甩干后用共聚焦激光掃描儀LuxScanTM10K(CapitalBio公司)進行圖像掃描，應用GenePix pro V6.0 軟件進行數據處理和分析。

1.6隨訪時間

所有患者均接受隨訪，隨訪截止時間是2014年10月1日，中位隨訪時間是14個月(3～42個月)。

1.7統計學方法

miRNA芯片數據標準化后，應用Significance Analysis of Microarrays軟件和非配對t檢驗分析GBM患者和健康志愿者血漿miRNA 表達差異，篩選差異表達在1.5倍以上和P<0.05的miRNA。將各差異表達miRNA芯片檢測的相對表達量中位數作為分界值，分別將患者分為低表達組和高表達組。采用Kaplan-Meier方法進行生存分析，并采用Log-rank檢驗比較兩組生存率。應用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1MiRNA表達譜

與健康志愿者相比，GBM患者血漿中表達上調1.5倍以上的miRNA有3種，表達下調1.5倍以上的miRNA有16種， 兩組miRNA相對表達值見表1。

miRNA 膠質母細胞瘤組(n=22)健康志愿者組(n=8)表達情況差異倍數Phsa-miR-30c-2-3p11.119±0.47710.597±0.182上調1.5020.015hsa-miR-319712.632±0.68711.849±0.798上調1.6640.025hsa-miR-451a13.247±0.94812.212±1.221上調1.8010.041hsa-miR-4760-3p10.639±0.24711.065±0.704下調0.6620.022hsa-miR-877-3p10.619±0.19711.110±0.598下調0.661<0.001hsa-miR-485-3p10.747±0.23011.295±0.501下調0.657<0.001hsa-miR-444911.093±0.21311.638±0.544下調0.652<0.001hsa-miR-142-3p11.016±0.23011.546±0.563下調0.649<0.001hsa-miR-427014.740±0.62215.467±0.488下調0.6300.013hsa-miR-5196-3p9.917±0.53410.666±0.206下調0.627<0.001hsa-miR-197-5p13.939±0.68714.760±0.310下調0.615<0.001hsa-miR-4667-5p13.405±0.63214.154±0.702下調0.5790.015hsa-miR-473011.273±0.66712.191±0.729下調0.528<0.001hsa-miR-3184-5p13.329±0.77214.254±0.736下調0.528<0.001hsa-miR-449c-5p12.644±2.31614.712±0.756下調0.5190.018hsa-miR-3689a-3p10.505±0.96211.435±1.220下調0.4770.031hsa-miR-1225-5p11.827±0.58012.965±0.480下調0.467<0.001hsa-miR-318012.418±0.80513.312±1.364下調0.4520.031hsa-miR-429811.317±0.59312.531±0.443下調0.448<0.001

2.2差異表達miRNA與GBM患者生存的關系

應用Kaplan-Meier方法對22例GBM患者進行生存分析。結果顯示：miR-30c-2-3p高表達組患者中位無疾病進展時間(progression-free survival,PFS)為11.9個月，較低表達組患者(未達到)明顯縮短，兩組的差異有統計學意義(Log-rank檢驗：P=0.016)(圖1)，而中位總生存時間(overall survival,OS)的差異接近有統計學意義(P=0.073)。另有兩個差異性表達的miRNA(miR-4667-5p和miR-3180)的低表達組患者中位PFS和中位OS，較高表達組患者縮短，差異接近有統計學意義(表2)。其余差異表達的miRNA未顯示出預后價值。

表2　部分差異表達miRNA與GBM患者生存的關系

圖1　miR-30c-2-3p表達與患者預后的關系

3討論

miRNA是1類內源性的具有調控功能的小分子、單鏈非編碼RNA，在細胞代謝、分化、增殖和凋亡等生物學過程中發揮著重要的調控作用。 miRNA表達的組織特異性、腫瘤組織和瘤旁組織間差異表達及其調控機制是近年來研究的熱點，已成為腫瘤潛在分子生物標志物。本研究利用循環miRNA穩定的特點，通過高通量、涵蓋廣的miRNA芯片技術，分析發現了19個在GBM患者血漿中差異表達在1.5倍以上的miRNA，其中3個表達上調，16個表達下調。這些差異表達miRNA可能為早期診斷提供了非侵入性的篩選方法。此外，我們的研究發現miR-30c-2-3p高表達與GBM患者不良預后相關。

研究表明，miR-30家族(miR-30a、miR-30b和 miR-30c)不同表達水平與腫瘤細胞增殖和分化，以及藥物反應性有關[8]。文獻報道miR-30c的低表達在結直腸癌、膀胱癌、肺癌和腎癌等中具有預后價值[9-12]。Wang等[10]研究膀胱癌miRNA差異表達譜發現miR-30c和miR-30e-5p下調。Heinzelmann等[11]研究發現腎透明細胞癌miR-30c的低表達與腫瘤侵襲能力和遠處轉移有關。但也有文獻報道與上述研究結果并不一致。在Shen等[13]的肝細胞癌患者血漿miRNA的研究中，發現miR-30c呈高表達。同樣在本研究中，我們發現GBM患者血漿miR-30c-2-3p呈高表達，并且生存分析顯示miR-30c-2-3p高表達組患者生存期顯著短于低表達組。提示 miR-30c-2-3p可能可以作為早期診斷和預測預后的指標，但仍需要進一步研究驗證。

此外，miR-451a也被發現在多種惡性腫瘤中有表達變化。miR-451a在結腸癌、肺癌、肝癌等組織或細胞系低表達[14-16]。同樣研究者有不同的結果，發現miR-451a在腫瘤組織或細胞系高表達[17-19]。而在膠質瘤組織學或細胞系的研究中，多數發現miR-451a呈低表達[20-22]。如Gal等[20]研究表明，miR-451在惡性膠質瘤干細胞中低表達，并且發現miR-451聯合甲磺酸伊馬替尼能抑制膠質瘤干細胞的增殖和分化。miR-45l參與膠質瘤細胞調解機制復雜，至今尚未明確的結論。在我們研究中，發現GBM患者血漿中miR-451a呈高表達，這可能與腫瘤細胞類型來源、分化程度等有關。本研究發現的其他差異性表達的miRNA在國內外文獻中鮮有報道。

總之,我們分析了GBM患者與健康志愿者血漿miRNA表達譜,發現了19個存在差異性表達的miRNA。并且miR-30c-2-3p的高表達與GBM的不良相關，可能是潛在的GBM預后預測分子標記物。但本實驗中樣本例數相對較少，需要擴大樣本量進一步深入研究和臨床驗證。

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(編輯：吳小紅)

Plasma MicroRNA Expression Profiles in Glioblastoma

WANGZhiqiang,WANGHuiyun,DENGMeiling,etal.SunYat-senUniversityCancerCenter,Guangzhou,510060

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression profiles of microRNA(miRNA) in glioblastoma (GBM) by microarray technique and explore the potential molecular biomarker for GBM.MethodsPlasmas were obtained from 22 cases of GBM and 8 cases of healthy volunteers.Total RNA was extracted by RNA extraction kit and hybridized with miRNA microarrays.The miRNA expression profiles of GBM and healthy volunteers were analyzed and differential miRNA expression was determined.The correlation between differential miRNAs expression and survival was analysed by Kaplan-Meier method.ResultsMiRNA expression profiling was analyzed.19 miRNAs were identified to be deferentially expressed,in which 3 were overexpressed and 16 were underexpressed in GBM.Kaplan-Meier analysis showed that high expression of miR-30c-2-3p was closely associated with a shorter progression-free survival time (P=0.016).Conclusion19 deferentially expressed miRNAs are detected in GBM by microarray method.High expression of miR-30c-2-3p is associated with poor prognosis of patients with GBM.MiR-30c-2-3p may serve as a potential molecular prognosis marker.

【Key words】Glioblastoma;Plasma;MicroRNA;microarray

(收稿日期2015-01-01修回日期 2015-03-10)

中圖分類號：R739.91

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2015)04-0475-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.04.001

通訊作者：吳少雄