胰島素樣生長因子結合蛋白5與漢防己甲素抑制人結腸癌細胞增殖的關系研究

王東旭，袁霜雪，伍秋香，任春美，陳振華，顧格瑜，李紹春，孫文娟，吳 柯，何百成

（重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶醫科大學藥理教研室，重慶 400016）

胰島素樣生長因子結合蛋白5與漢防己甲素抑制人結腸癌細胞增殖的關系研究

王東旭，袁霜雪，伍秋香，任春美，陳振華，顧格瑜，李紹春，孫文娟，吳 柯，何百成

（重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶醫科大學藥理教研室，重慶 400016）

中國圖書分類號：R284.1；R329.24；R329.25；R735.350.22；R977.6

摘要：目的 研究漢防己甲素（tetrandrine，Tet）抑制結腸癌細胞增殖作用及其可能的分子機制。方法 采用結晶紫染色和流式細胞術檢測不同濃度Tet對結腸癌LoVo細胞增殖的抑制作用。采用流式細胞術分析Tet對LoVo細胞凋亡的促進作用。利用Western blot檢測Tet對IGFBP-5的表達影響。采用熒光素酶報告質粒，IGFBP5以及IGFBP5 siRNA的重組腺病毒，研究Tet抑制結腸癌細胞增殖的分子機制。結果 Tet能明顯抑制LoVo細胞增殖，并能誘導G1期阻滯，同時促進LoVo細胞凋亡。Tet呈濃度依賴性降低LoVo細胞中IGFBP5的表達水平。與對照組相比，Tet明顯抑制TOP-luc報告質粒的轉錄活性，外源性過表達IGFBP5能部分逆轉這種抑制作用；Tet明顯下調LoVo細胞中c-Myc表達水平，外源性過表達IGFBP5能部分逆轉，但沉默IGFBP5表達不能逆轉Tet對c-Myc表達水平的抑制作用。結論 Tet能抑制結腸癌細胞LoVo的增殖，并誘導凋亡，這種作用可能與Tet通過下調IGFBP5表達進而抑制Wnt／β-catenin信號有關。

關鍵詞：漢防己甲素；結腸癌；增殖抑制；細胞凋亡；IGFBP5；Wnt／β-catenin信號

網絡出版時間：2015－9－14 14：53 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．032．html

漢防己甲素（tetrandrine，Tet）又名漢防己堿，屬于二芐基異喹啉類生物堿，來源于傳統中藥防己科植物粉防己（漢防己，Stephaniatetrandra S．Moore）的干燥根。近年研究顯示，Tet能抑制多種腫瘤細胞的增殖并促進其凋亡，如肝癌、乳腺癌和結腸癌等，但該作用的具體分子生物學機制目前仍不十分清楚［1－3］。

結腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤，具有較高發病率和致死率。目前，結腸癌的診斷和治療水平都有了較大提高，但其治療效果及預后仍不十分樂觀。因此，尋找新的藥物靶點或開發新的治療藥物是目前攻克結腸癌所面臨的主要挑戰之一。研究表明，胰島素樣生長因子（Insulin-like growth factor，IGF）信號通路與結腸癌發生關系密切［4－6］，可能是結腸癌治療潛在的有效靶點之一［7］。

IGFBP-5對IGF信號具有重要調節作用。文獻報道，IGFBP-5與多種腫瘤細胞的增殖和凋亡有關，如乳腺癌、肝癌和骨肉瘤等［8-10］。但是，IGFBP-5對腫瘤細胞的作用存在爭議：既可以抑制腫瘤細胞生長，也可以促進腫瘤細胞生長。Tet對結腸癌細胞的增殖具有明顯抑制作用［2］，但目前仍不清楚IGFBP5是否與這種作用有關。

本研究主要分析IGFBP5與Tet抑制結腸癌細胞的增殖關系。旨在進一步深詮釋Tet抑制結腸癌細胞增殖的分子機制，為將Tet用于結腸癌的治療提供實驗和理論依據。

1　材料與方法

1．1試劑及細胞培養 漢防已甲素購自Sigma-Aldrich公司。人結腸癌LoVo細胞購自ATCC（A-merican Type Culture Collection）。實驗所用IGFBP-5 和c-Myc等一抗均購自Santa Cruz Biotechnology公司。Lipofectamine2000購自Invitrogen公司。采用DMEM培養基（高糖）進行細胞培養（10%的胎牛血清、100 kU·L－1青霉素以及0.1 g·L－1鏈霉素），培養條件為5%的CO2和37℃。

1．2構建重組腺病毒 本研究所用重組腺病毒采用AdEasy系統構建［11］，簡述如下：以EST克隆為模板，采用PCR將目的基因編碼序列擴增（或人工合成的siRNA片段）并克隆到穿梭質粒。最后，將穿梭質粒線性化，并與骨架質粒進行同源重組，將重組正確的質粒線性化后轉染HEK-293細胞（human embryonic kidney-293）進行病毒包裝，得到含目的基因編碼序列的重組腺病毒載體。包括綠色熒光蛋白重組腺病毒（AdGFP）、IGFBP5重組腺病毒（AdIGFBP5）和IGFBP5的siRNA重組腺病毒（AdsiIGFBP5）。

1．3結晶紫染色實驗 將指數生長的LoVo細胞均勻種于24孔板中，按實驗設計用相應濃度的Tet處理細胞。在相應時間點進行結晶紫染色，分析細胞的增殖情況。方法簡述如下［3］：棄培養基，用PBS小心清洗孔板。然后，每孔加入500 μL結晶紫飽和溶液（采用PBS緩沖的10%甲醛配制），在室溫下孵育20 min。最后，棄結晶紫染液，并且用自來水小心將孔板清洗干凈。室溫下將孔板晾干，并用掃描儀掃描。用20%的乙酸溶液溶解結晶紫，并通過酶標儀測定吸光度以便進行定量分析，測定波長為590 nm。每組實驗重復3次。

1．4Western blot實驗 將指數生長的LoVo細胞均勻種于6孔板，等細胞貼壁后按實驗設計加入相應處理因素。于處理后24 h和（或）48 h提取總蛋白，并用BCA法測定各組總蛋白濃度。采用SDS-PAGE法進行Western blot操作，采用ECL化學發光法顯影并成像。每組實驗重復3次。

1．5凋亡檢測實驗 將處于指數生長期的LoVo細胞均勻種于6孔板，待細胞貼壁后按實驗設計加入相應處理因素。48 h后收集培養基及貼壁的細胞并用PBS（4℃）清洗；利用Annexin V-EGFP和PI進行孵育（按試劑盒說明進行操作），然后通過流式細胞儀進行凋亡檢測。每組實驗重復3次。

1．6周期檢測試驗 將處于指數生長期的LoVo細胞均勻種于6孔板，貼壁后按要求加入相應處理因素。48 h后，小心棄去培養基，收集細胞并用PBS （4℃）清洗，通過流式細胞儀進行細胞周期分析（按試劑盒的操作說明進行）。每組實驗重復3次。

1．7螢光素酶報告質粒檢測實驗 將指數生長狀態的LoVo細胞種于T25培養瓶中，貼壁后用Lipo-fectamine2000轉染LEF／TCF4報告質粒（pTOP-Luc）3 μg，4 h后換液。12 h后將細胞收集并重新種于24孔板中，并分別用不同濃度的Tet處理。24 h后，棄培養基并裂解細胞，按試劑盒操作說明測定螢光素酶活性。用BCA法測定裂解液總蛋白濃度，用于標準化螢光素酶活性。每組實驗重復3次。

2　結果

2．1Tet明顯抑制結腸癌LoVo的增殖 結晶紫染色結果顯示，Tet能有效地抑制LoVo細胞增殖，并且呈濃度依賴性（Fig 1A）；Tet在5 μmol·L－1時就能明顯抑制LoVo細胞的增殖。流式細胞分析結果表明，與對照組相比，Tet可以誘導細胞停滯在G1期（Fig 1C）。結果提示，Tet對LoVo細胞的增殖具有抑制作用。

Fig 1 Effects of Tet on proliferation of LoVo cells

2．2Tet能促進結腸癌LoVo凋亡 本研究進一步分析Tet是否可以誘導結腸癌細胞凋亡。流式細胞儀分析結果顯示，與對照組相比，加入Tet后細胞凋亡率明顯增加，且凋亡細胞的百分比呈濃度依賴性增加（Fig 2A）。Western blot分析結果顯示，Tet能明顯增加Bad的水平，但同時降低Bcl-2的水平（48 h時最明顯）。以上結果提示，Tet抑制LoVo細胞增殖與促進細胞凋亡有關。

2．3Tet抑制LoVo細胞增殖與下調IGFBP5表達有關 IGFs信號異常是腫瘤發生的重要原因之一。IGFBP5對IGFs信號具有重要調節作用，但IGFBP5與結腸癌的確切關系目前還不十分清楚。因此，本研究擬分析Tet抑制LoVo細胞增殖是否與IGFBP5有關。Western blot結果顯示，Tet在LoVo細胞中可以明顯降低IGFBP5的表達水平（Fig 3A）。提示，IGFBP5可能與Tet抑制LoVo細胞增殖有關。利用重組腺病毒介導的IGFBP5過表達或沉默表達進一步分析。結果顯示，Tet明顯導致G1期阻滯，外源性過表達IGFBP5能部分逆轉Tet的G1期阻滯作用，而IGFBP5沉默表達則明顯增強Tet對LoVo細胞的G1期阻滯作用（Fig 3B）；Tet明顯促進LoVo細胞凋亡，外源性過表達IGFBP5明顯降低Tet對LoVo細胞的凋亡促進作用，而IGFBP5沉默表達則明顯增加死亡LoVo細胞的百分比（Fig 3C）。結果提示，下調IGFBP5表達可能與Tet抑制LoVo細胞增殖有關，但具體分子機制尚不清楚。

2．4IGFBP5逆轉Tet對Wnt／β-catenin信號的抑制作用 Wnt／β-catenin信號異常激活是結腸癌最常見的發病原因之一。課題組前期結果顯示，Tet對結腸癌細胞中的Wnt／β-catenin信號具有明顯抑作用［3］。因此，本研究進一步分析，Tet下調IGFBP5表達是否與其抑制Wnt／β-catenin信號轉導有關。熒光素酶報告質粒結果顯示，Tet明顯抑制pTOP-Luc報告質粒的轉錄活性，但外源性過表達IGFBP5能部分逆轉Tet的作用（Fig 4A）。Western blot結果表明，Tet可以明顯抑制c-Myc在LoVo細胞中表達；外源性過表達IGFBP5能明顯逆轉Tet對C-myc表達的抑制作用，但沉默IGFBP5表達則增強Tet的這種抑制作用（Fig 4B）。提示，IGFBP5在Tet抑制LoVo細胞增殖中的作用可能與調節Wnt／β-catenin信號轉導有關。

3　討論

漢防己甲素（Tet）屬于二芐基異喹啉類生物堿，來源于傳統中藥防己科植物粉防己的干燥根［1］。Tet對多種腫瘤細胞具有抑制增殖和促進其凋亡的作用，如肝癌、乳腺癌和結腸癌等。本研究表明，Tet能抑制結腸癌細胞增殖，這種作用可能與Tet通過下調IGFBP5表達實現對Wnt／β-catenin信號的抑制有關，但IGFBP5對Wnt／β-catenin的調節體機制尚不清楚。

Fig 2 Effects of Tet on apoptosis in LoVo cells

IGF信號參與細胞增殖、分化和凋亡的調節，因此，該信號在胚胎和個體發育及腫瘤發生過程中具

有重要作用。IGF信號通路成員眾多，包括兩種多肽生長因子（IGF-1和IGF-2），細胞表面與IGFs結合的兩類相應受體（IGF-1受體和IGF-2受體），7種與IGFs結合的蛋白（IGFBP1～IGFBP7），以及一系列降解IGFBPs的蛋白酶［12］。IGFBP5是IGF信號的關鍵調節因子之一。文獻報道，IGFBP5與多種腫瘤的發生密切相關，如乳腺癌、肝癌和骨肉瘤等［8－10］。但是，IGFBP5對腫瘤細胞增殖的抑制作用存在爭議：IGFBP5雖能抑制部分腫瘤細胞生長，但卻能促進另外的一些腫瘤細胞生長。這種原因可能與細胞的微環境、細胞種類以及IGFBP5在胞內的定位有關，同時也與IGFBP5各結構域的功能狀態有關［13－14］。本研究發現，Tet能抑制結腸癌細胞的增殖，這種作用可能與Tet下調IGFBP5的表達有關。因此，我們推測IGFBP5可能與結腸癌的發生關系密切，是結腸癌治療的潛在靶點之一。

Fig 3 IGFBP5 associated with the anti-proliferating effects of Tet on LoVo cells

Fig 4 Effect of IGFBP5 on Wnt／β-catenin signaling repressed by Tet

Wnt信號的異常活化被認為是結腸癌發生的重要原因之一［15］。該信號參與個體胚胎發育及正常生理功能調控，根據其功能的發揮是否依賴于β-catenin而將Wnt信號分為經典Wnt信號通路與非經典Wnt信號通路。在經典的Wnt信號通路中，β-catenin對于該信號的轉導具有中樞作用，故該通路

習慣上被叫作Wnt／β-catenin信號通路。當Wnt配體與胞膜上的受體卷曲蛋白（Frizzled protein，Fzds）結合后，能阻止胞質中的降解復合物（Axin-APC-GSK3β）形成，使β-catenin的泛素化降解被抑制；導致胞質內β-catenin水平升高，并轉位入核，與其他相應的的轉錄因子結合，調節下游靶基因表達。反之，當Fzds未與Wnt配體結合時，胞質中β-catenin降解復合物形成，促使β-catenin降解，降低胞內β-catenin水平，進而抑制Wnt／β-catenin信號［16］。實驗結果顯示，Tet明顯抑制pTOP-Luc報告質粒的轉錄活性，但外源性過表達IGFBP5可以部分翻轉Tet的這種作用（Fig 4A）。c-Myc是Wnt／β-catenin信號的重要靶基因，在結腸癌中表達水平較高。

本研究表明，Tet對Wnt／β-catenin信號轉導的抑制作用可能與下調IGFBP5表達有關；IGFBP5對于Wnt／β-catenin信號轉導可能具有重要促進作用，但其具體調節機制還有待進一步深入研究。

［致謝：本實驗在重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室完成。感謝芝加哥大學何通川（Tongchuan He）教授慷慨為本研究提供實驗所需的重組腺病毒載體。］

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Study on the relationship between Insulin-like growth factor binding protein 5 and anti-proliferating effect of tetrandrine on human colon cancer cells

WANG Dong-xu，YUAN Shuang-xue，WU Qiu-xiang，REN Chun-mei，CHEN Zhen-hua，GU Ge-yu，LI Shao-chun，SUN Wen-juan，WU Ke，HE Bai-cheng
（Chongqing Key Labrotory of Biochemistry and Molecular Pharmacology，Chongqing 400016，China，Dept of Pharmacology，Pharmacy School of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

Abstract：Aim To investigate the anti-proliferatingeffect of tetrandrine（Tet）on colon cancer cells and its

possible molecular mechanism．Methods We intro-duced crystal violet staining and flow cytometry to ana-lyze the effect of Tet on proliferation in LoVo cells．Flow cytometry was used to detect the effect of Tet on apoptosis in LoVo cells．Western blot assay was taken to analyze the effect of Tet on the expression of insulin-like growth factor binding protein 5（IGFBP5）．Final-ly，luciferase reporter assay，recombinant adenovirus mediated over-expression or silence of IGFBP5 were used to analyze the possible role of IGFBP5 in the anti-proliferating effect of Tet on colon cancer cells．Re-sults Crystal violet staining and flow cytometery anal-ysis results showed that Tet could exert an anti-prolifer-ating effect and induce apoptosis in LoVo cells．Tet de- creased the expression of IGFBP5 in a concentration-dependent manner．Tet inhibited the transcriptional ac-tivity of pTOP-luc reporter，which could be reversed by exogenous expression of IGFBP5 mostly．Similar results were found in the expression of c-Myc，but IGFPB5 knockdown couldn’t reverse this effect．Conclusion Tet can inhibit the proliferation of colon cancer cells，and this effect may be mediated by down-regulating the expression of IGFBP5 to inhibit Wnt／β-catenin signa-ling transduction partly．

Key words：tetrandrine；colon cancer；anti-prolifera-tion；cell apoptosis；IGFBP5；Wnt／β-catenin signa-ling

作者簡介：王東旭（1989－），女，碩士生，研究方向：分子藥理學，E-mail：505484224＠qq．com；何百成（1972－），男，博士，教授，研究方向：分子藥理學和干細胞生物學，通訊作者，E-mail：hebaicheng99＠ya-hoo．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81372120）

收稿日期：2015－06－23，修回日期：2015－07－29

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1403－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．016