三七皂苷R1對肺高壓大鼠肺動脈平滑肌細胞SOCE的抑制作用

王瑞幸，戴 耄，穆云萍，江 嬌，黃秋虹，吳枝娟，焦海霞，林默君

（福建醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系，心血管科學研究室，福建福州 350108）

三七皂苷R1對肺高壓大鼠肺動脈平滑肌細胞SOCE的抑制作用

王瑞幸，戴 耄，穆云萍，江 嬌，黃秋虹，吳枝娟，焦海霞，林默君

（福建醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系，心血管科學研究室，福建福州 350108）

中國圖書分類號：R-332；R284．1；R322．121；R322．74；R543.502；R544.02；R845.22

摘要：目的 探討三七皂苷R1（notoginsenoside R1）對慢性低氧（chronic hypoxia，CH）及野百合堿（monocrotaline，MCT）致肺高壓（pulmonary hypertension，PH）大鼠肺動脈平滑肌細胞（pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs）鈣池操縱性鈣內流（store-operated calcium entry，SOCE）的作用。方法制備CH及MCT致PH大鼠模型，通過Mn2＋淬滅Fura-2熒光和Fluo-3熒光檢測胞質游離Ca2＋濃度（intracellular free calcium concentration，［Ca2＋］i）觀察三七皂苷R1對CH及MCT致PH大鼠PASMCs SOCE的作用。結果 成功制備CH及MCT致PH大鼠模型；在硝苯地平預處理情況下，10 μmol·L－1三七皂苷R1可明顯降低環匹阿尼酸（cyclopia-zonic acid，CPA）誘導CH及MCT致PH大鼠PASMCs Mn2＋淬滅幅度、Mn2＋最大淬滅率、胞膜Ca2＋內流量和靜息［Ca2＋］i。結論 三七皂苷R1對CH及MCT致PH大鼠PASMCs具有抑制SOCE和降低靜息［Ca2＋］i的作用。

關鍵詞：肺高壓；慢性低氧；野百合堿；三七皂苷R1；鈣池操縱性鈣內流；肺動脈平滑肌細胞

網絡出版時間：2015－9－14 14：53 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．054．html

肺高壓（pulmonary hypertension，PH）是與許多不同病理特征和發病機制的疾病密切相關的病理生理學改變［1］。它是一種以進行性肺血管重構為特征的嚴重疾病，表現為肺血管阻力增高，肺動脈壓力增高，右心室肥厚，最終可引起右心衰竭，甚至死亡［2］。目前研究表明，肺動脈平滑肌細胞（pulmona-ry arterial smooth muscle cells，PASMCs）靜息胞質游離Ca2＋濃度（intracellular free calcium concentration，［Ca2＋］i）水平持續性增高，在血管收縮增強和血管重塑以及PH致病過程中起重要作用［3］。在特發性肺動脈高壓患者、慢性低氧（chronic hypoxia，CH）和野百合堿（monocrotaline，MCT）誘導PH模型動物中靜息［Ca2＋］i的升高和肺動脈（pulmonary arter-ies，PAs）血管張力的增加主要是由鈣池操縱性鈣內流（store-operated calcium entry，SOCE）功能增強引起［4－7］。雖然PH的研究取得了明顯的進展，但迄今尚缺乏有效的治療手段。目前，主要治療方法是應用血管擴張劑，如前列腺素、磷酸二酯酶抑制劑和內皮素-1受體拮抗劑等，但這些藥物價格昂貴，且療效有限。

近年來研究發現，從傳統中藥三七中提取的活性成分三七皂苷R1（notoginsenoside R1）具有減輕低氧和高碳酸血癥誘導游離大鼠肺動脈環收縮的作用［8］，我們先前研究也發現，三七皂苷R1可能通過抑制SOCE，降低血管激動劑對肺高壓模型大鼠肺動脈的收縮作用［9］。本研究進一步觀察三七皂苷R1對CH及MCT致PH模型大鼠PASMCs SOCE的作用。

1　材料與方法

1．1實驗動物和分組 清潔級SD大鼠，♂，體質量180～200 g，購自福建醫科大學實驗動物中心［SCXK（閩）2012－0001］，隨機分成正常對照組（CON組）、CH致PH模型組（CH組）和MCT誘發PH模型組（MCT組）3組。

1．2試劑 MCT、膠原酶Ⅰ、木瓜蛋白酶、環匹阿尼酸（cyclopiazonic acid，CPA）、硝苯地平（nifedipine，Nif）、CaCl2、MnCl2、EGTA和A23187均為Sigma公司產品；Fluo-3，AM和Fura-2，AM（Invitrogen公司）；三七皂苷R1（成都格雷西亞化學技術有限公司）。

1．3PH大鼠模型的建立

1．3．1CH誘發PH大鼠模型的建立大鼠置于常壓低氧（體積分數為0．1）密封的有機玻璃飼養箱內，飼養21 d。

1．3．2MCT誘發PH大鼠模型的建立［7］大鼠按

50 mg·kg－1劑量一次腹腔注射61．5 mmol·L－1MCT后，常規飼養21 d。

1．4PH大鼠模型的鑒定

1．4．1右心室收縮壓測定 大鼠腹腔注射肝素（Heparin，3125 IU·kg－1）5min后，氨基甲酸乙酯（1 g·kg－1）腹腔麻醉后，經右頸外靜脈行右心室插管術，記錄大鼠右心室收縮壓（right ventricular sys-tolic pressure，RVSP）。

1．4．2右心室質量指數測定 測完RVSP后，迅速剪開胸腔取出大鼠的心臟和肺。沿房室交界處剪去左右心房及血管，分離右心室（RV）及左心室＋室間隔（LV＋S），并用濾紙吸去多余水分，分別稱重，計算RV／（LV＋S）即右心室質量指數（right ventricular mass index，RVMI）。

1．4．3肺動脈形態學檢測 將取下的肺以1.47 kPa壓力沿氣管注入甲醛，固定24 h，石蠟包埋，在距離肺尖約0．5 cm處切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察肺血管形態。用Image Pro 6.0軟件分別測量并計算直徑為51－100 μm和101－150 μm肺動脈的管腔面積與總面積的百分比，以及管壁厚度與動脈半徑的百分比。

1．5PASMCs的分離和培養 大鼠麻醉后，迅速剪開胸腔取出肺葉，在解剖顯微鏡下分離肺葉內PAs，沿PAs縱軸剪開暴露內壁，用棉簽在PAs內壁小心擦拭以去內皮。分離好的PAs放在4℃含1.5 mmol·L－1CaCl2的HBSS液（mmol·L－1：NaCl 130.0，KCl 5.0，MgCl21.2，HEPES 10.0，Glucose 10.0，pH 7.2）中靜置30 min，隨后取出放入室溫下含20 μmol·L－1CaCl2的HBSS液中靜置20 min。再將PAs放入酶溶液（L－1：膠原酶Ⅰ1.75×106U，木瓜蛋白酶9.50×103U，牛血清白蛋白0.03 mmol，DTT 1.00 μmol；用含20 μmol·L－1CaCl2的HBSS液配制）中37℃水浴消化20 min，后用尼龍網濾去酶溶液，并用含20 μmol·L－1CaCl2的HBSS液清洗PAs，后再將其置于0.5 mL含20 μmol·L－1CaCl2的HBSS液中慢慢吹打，使細胞脫落并分散于溶液中。將細胞懸液滴于細胞培養皿中，加F12細胞培養液，于體積分數為0.21氧氣的培養箱（CON組和MCT組細胞）或體積分數為0.03氧氣的三氣培養箱（CH組細胞）中37℃培養18～24 h。

1.6Mn2＋淬滅Fura-2熒光實驗 培養好的PASMCs用Fura-2 AM（5 μmol·L－1）在室溫下培養液中負載40 min，負載結束后，細胞用含2 mmol· L－1CaCl2的Tyrode液（mmol·L－1：NaCl 137.0，KCl 5.4，MgCl21.0，HEPES 10.0，Glucose 10.0，pH 7.4）沖洗以去除細胞外的Fura-2 AM，并靜置20 min，以使細胞內染料完全脫酯化。將細胞放置于倒置顯微鏡上，選擇視野中形態好且密集的細胞團。啟動實時細胞動態熒光強度系統，設置激發光波長為360 nm，發射光波長為510 nm，按實驗程序經給藥灌流系統加入相應的灌流液，記錄與分析Fura-2熒光變化。Fura-2熒光變化的計算公式為：ΔFluorescence%＝（F－Fbs）（Fbs－Fbg）×100%，F為實時測量熒光值，Fbs為含0.1 mmol·L－1EGTA的無鈣Tyrode液中得到的基礎熒光值，Fbg為10 μmol·L－1A23187和10 mmol·L－1MnCl2誘發的背景熒光值。并用Clampfit 8.2軟件計算Mn2＋最大淬滅率（maximum rate of quenching）。三七皂苷R1處理組為實驗前培養液中加入10 μmol·L－1三七皂苷R1預孵育細胞10 min，并在給藥灌流系統各灌流液中加入10 μmol·L－1三七皂苷R1。

1．7Fluo-3熒光檢測PASMCs的［Ca2＋］i培養好的PASMCs用Fluo-3 AM（5 μmol·L－1）在室溫下培養液中負載40 min，負載結束后，細胞用含2 mmol·L－1CaCl2的Tyrode液沖洗以去除細胞外的Fluo-3 AM，并靜置20 min，以使細胞內染料完全脫酯化。將細胞放置于倒置顯微鏡上，選擇視野中形態好且密集的細胞團。啟動實時細胞動態熒光強度系統（美國PTI公司），設置激發光波長為488 nm，發射光波長為510 nm，按實驗程序經給藥灌流系統加入相應的灌流液，記錄與分析Fluo-3熒光變化。［Ca2＋］i的計算公式為：［Ca2＋］i＝KD×（F－Fbg）／（Fmax－F），其中Fluo-3的KD值為1.1 μmol·L－1，F為實時測量熒光值，Fbg為10 mmol·L－1MnCl2誘發的背景熒光值，Fmax為10 μmol·L－1A23187和10 mmol·L－1CaCl2誘發的最大熒光值。三七皂苷R1處理組為實驗前培養液中加入10 μmol·L－1三七皂苷R1預孵育細胞10 min，并在給藥灌流系統各灌流液中加入10 μmol·L－1三七皂苷R1。

2　結果

2．1PH大鼠模型的鑒定

2．1．1RVSP和RVMI的變化 CH組和MCT組大鼠的RVSP和RVMI均明顯高于CON組（Fig 1），這表明CH和MCT均可致大鼠的右心室內壓增高，肺動脈阻力增高；右心室肥大，右心室重構。

Fig 1 Change of RVSP（A），RVMI（B），and PAs morphology（C and D）of control，CH-and MCT-treated rats

2．1．2肺動脈形態學的改變 與CON組相比（Fig 1）：CH組和MCT組大鼠肺動脈的管腔面積與總面積的百分比均明顯減小；管壁厚度與動脈半徑的百分比則均明顯升高。以上結果表明，CH和MCT均可致大鼠的肺內動脈平滑肌增生，血管重構。

2．2三七皂苷R1對CPA誘導大鼠PASMCs胞膜Ca2＋內流的作用 用Mn2＋淬滅技術觀察10 μmol ·L－1CPA的無鈣Tyrode液（含0.1 mmol·L－1EGTA和3 μmol·L－1Nif）作用PASMCs 15 min后的胞膜Ca2＋（Mn2＋代替Ca2＋）內流即SOCE的變化［10］。結果顯示（Fig 2）：CH組和MCT組大鼠CPA誘導PASMCs胞膜Ca2＋內流速率均明顯高于正常組大鼠［500 s的ΔFluorescence值：CON組＝（－41.7±9.5）%，n＝10；CH組＝（－53.4± 10.5）%，n＝10，P＜0.01；MCT組＝（－70.3± 7.0）%，n＝10，P＜0.01。Mn2＋最大淬滅率：CON組＝（－1.34±0.40）%·s－1，n＝10；CH組＝（－2.61±0.88）%·s－1，n＝10，P＜0.01；MCT組＝（－3.51±1.56）%·s－1，n＝10，P＜0.01］，提示CH組和MCT組大鼠PASMCs的SOCE功能增強。10 μmol·L－1三七皂苷R1預處理均可明顯抑制CH組和MCT組大鼠CPA誘導PASMCs胞膜Ca2＋內流速率［500 s的ΔFluorescence值：CON組＝（－31.1±7.5）%，n＝10，P＜0.05；CH組＝（－38.2±8.2）%，n＝10，P＜0.01；MCT組＝（－50.4 ±8.3）%，n＝9，P＜0.01；Mn2＋最大淬滅率：CON組＝（－0.86±0.36）%·s－1，n＝10，P＜0.01；CH組＝（－1.75±0.42）%·s－1，n＝10，P＜0.01；MCT組＝（－1.64±0.51）%·s－1，n＝9，P＜0.01］。這提示三七皂苷R1均可抑制CH組及MCT組大鼠PASMCs的SOCE功能。

Fig 2 Effect of notoginsenoside R1 on CPA-induced Ca2＋entry by Mn2＋quenching in PASMCs of control，CH-and MCT-treated rats

Fig 3 Effect of notoginsenoside R1 on CPA-induced Ca2＋transients in PASMCs of control，CH-and MCT-treated rats

2．3三七皂苷R1對CPA誘導大鼠PASMCs ［Ca2＋］i變化的作用 10 μmol·L－1CPA的無鈣Tyrode液（含0.1 mmol·L－1EGTA和3 μmol·L－1Nif）作用PASMCs 15 min，隨后加入Ca2＋（2 mmol· L－1）觀察Ca2＋內流引起［Ca2＋］i的升高即SOCE的變化［10］。結果顯示（Fig 3）：相比CON組，CH組和MCT組大鼠的靜息［Ca2＋］i明顯增高［靜息［Ca2＋］i：CON組＝（119.9±43.5）nmol·L－1，n ＝8；CH組＝（285.6±72.5）nmol·L－1，n＝9，P ＜0.01；MCT組＝（271.2±94.6）nmol·L－1，n＝8，P＜0.01）］；CH組和MCT組大鼠的CPA誘導

Ca2＋內流量也明顯增高［Ca2＋內流：CON組＝（213.2±49.1）nmol·L－1，n＝8；CH組＝（406.1 ±103.5）nmol·L－1，n＝9，P＜0.01；MCT組＝（581.1±147.5）nmol·L－1，n＝8，P＜0.01］；但CH組和MCT組大鼠的CPA誘導Ca2＋釋放量無明顯變化。這也說明CH組和MCT組大鼠PASMCs 對CPA的高反應性，從另一方面進一步提示MCT組大鼠PASMCs SOCE功能增強。10 μmol·L－1三七皂苷R1預處理可明顯降低CH組和MCT組大鼠PASMCs靜息［Ca2＋］i靜息［Ca2＋］i：CON組＝（75.9±31.1）nmol·L－1，n＝9，P＜0.05；CH組＝（151.6±34.0）nmol·L－1，n＝9，P＜0.01；MCT組＝（149.9±45.2）nmol·L－1，n＝8，P＜0.01］和抑制CPA誘導Ca2＋內流量［Ca2＋內流：CON組＝（139.6±34.9）nmol·L－1，n＝9，P＜0.01；CH組＝（231.1±45.5）nmol·L－1，n＝9，P＜0.01；MCT組＝（267.1±66.7）nmol·L－1，n＝8，P＜0.01］；但對CPA誘導Ca2＋釋放量也無變化。這從另一方面進一步證實三七皂苷R1可抑制CH組和MCT組大鼠PASMCs的SOCE功能。

3　討論

PH是指由不同發病機制引起的肺動脈壓力增高所表現的疾病狀態，可導致右心室肥厚，最終引起右心衰竭而死亡。PH屬于進展性疾病，嚴重威脅人類健康，迄今尚缺乏有效的治療手段。2013年第五次全球PH會議將PH重新分為以下5類［1］：①肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH），如特發性PAH和藥物和毒素引起PAH等；②左心疾病相關的PH；③與肺部疾病或低氧有關的PH；④慢性血栓栓塞性PH；⑤其他各種原因所造成的PH。本研究采用CH或MCT誘發PH模型分別代表第三類和第一類的PH。研究發現兩種造模大鼠RVSP、RVMI和肺動脈管壁厚度與動脈半徑的的百分比均明顯升高，而肺動脈管腔面積與總面積百分比均明顯減小，說明CH或MCT均可致大鼠肺內動脈平滑肌增生、血管重構、肺動脈阻力增高，右心室內壓增高導致右心室肥大和重構。這些結果表明CH或MCT誘發的PH大鼠模型均成功建立。

雖然不同類型的PH的發病機制各不相同，但它們都具有血管基礎張力和血管反應性增加、血管平滑肌增生和血管重構等肺血管功能異常的共同特點，說明它們在疾病發展過程中可能存在著某些共同的信號通路。目前研究表明，［Ca2＋］i水平的增加在PH形成和血管重構等過程中起重要作用［3］。SOCE是肺動脈平滑肌中一個很重要鈣內流通路，由Ca2＋池耗竭而激活［11］。先前的研究發現：特發性PAH患者PASMCs的SOCE增強［4］；CH致PH大鼠中，SOCE增強，PASMCs靜息［Ca2＋］i水平上升和肺動脈緊張度增加［5］，并在CHPH發生發展過程中起關鍵作用［6］；MCT誘發PH大鼠中，SOCE增強，且SOCE在ET-1高血管反應性中起重要作用［7］。這說明［Ca2＋］i增加和SOCE通路是不同PH發病機制中的共同通路。

三七總皂苷是人參屬中藥三七的主要有效活性成分。三七皂苷R1是三七總皂苷的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化應激、抗凋亡等藥理作用，可用于心血管系統疾病的治療［12－13］。我們研究發現，人參屬的人參皂苷Rb1抑制SOCE，降低正常和肺高壓大鼠肺動脈對血管激動劑的收縮作用［14］。相同的是，有研究發現三七皂苷R1具有減輕低氧和高碳酸血癥誘導游離大鼠肺動脈環收縮的作用［7］。我們先前研究也發現三七皂苷R1可能通過抑制SOCE，降低肺高壓模型大鼠肺動脈對血管激動劑的收縮作用［8］。然而，三七皂苷R1對CH及MCT致PH模型大鼠PASMCs SOCE的作用，目前尚不清楚。

為明確三七皂苷R1對PASMCs SOCE的作用，本研究采用SOCE特異性激活劑CPA。CPA是內質網Ca2＋泵抑制劑，通過抑制Ca2＋泵，將Ca2＋泵入內質網，引起內質網Ca2＋釋放所致的瞬時胞內Ca2＋濃度升高，然后隨著內質網Ca2＋的耗竭，特異性激活SOCE。通過Mn2＋淬滅Fura-2熒光實驗，在Nif預處理情況下，本研究發現三七皂苷R1可明顯抑制CH組和MCT組大鼠CPA誘導PASMCs胞膜Ca2＋內流速率，提示三七皂苷R1可抑制CH組及MCT組大鼠PASMCs的SOCE功能。通過另一種觀察SOCE的方法Fluo-3熒光檢測［Ca2＋］i［10］，在Nif預處理情況下，本研究發現三七皂苷R1可明顯降低CH及MCT致PH大鼠PASMCs靜息［Ca2＋］i和抑制CPA誘導Ca2＋內流，從另一方面進一步證實三七皂苷R1可抑制CH組及MCT組大鼠PASMCs的SOCE功能，這可能是三七皂苷R1降低CH及MCT 致PH大鼠PASMCs靜息［Ca2＋］i的主要因素。

總之，三七皂苷R1具有抑制CH和MCT致PH大鼠PASMCs SOCE和降低靜息［Ca2＋］i的作用，而［Ca2＋］i增加和SOCE通路是不同PH發病機制中的共同通路，因此三七皂苷R1對PH的臨床治療前景可觀。

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Inhibition of notoginsenoside R1 on SOCE in pulmonary arterial smooth muscle cells of pulmonary hypertension rats

WANG Rui-xing，DAI Mao，MU Yun-ping，JIANG Jiao，HUANG Qiu-hong，WU Zhi-juan，JIAO Hai-xia，LIN Mo-jun
（Dept of Physiology and Pathophysiology，Laboratory of Cardiovascular Science，Fujian Medical University，Fuzhou 350108，China）

Abstract：Aim To evaluate the effects of notoginsen-oside R1 on store-operated calcium entry（SOCE）in pulmonary arterial smooth muscle cells（PASMCs）of chronic hypoxia（CH）-and monocrotaline（MCT）-in-duced pulmonary hypertension（PH）rats．Methods Mn2＋quenching of Fura-2 and measurement of intra-cellular free calcium concentration（［Ca2＋］i）using fluo-3 were examined in PASMCs of CH-exposed and MCT-treated rats．Results ①CH-exposed and MCT-treated rats exhibited profound PH when examined 3 weeks after hypoxia exposure or MCT injection，respec-tively．②In the presence of 3 μmol·L－1nifedipine，10 μmol·L－1notoginsenoside R1 significantly re-duced cyclopiazonic acid（CPA）-induced the percent reduction in Fura-2 fluorescence measured 500 sec af-ter application of Mn2＋，the maximal rate of Mn2＋quenching，the amplitude of the Ca2＋influx transient and the resting［Ca2＋］iin PASMCs of CH-exposed and MCT-treated rats．Conclusion Notoginsenoside R1 inhibits SOCE and reduces resting［Ca2＋］iin PASMCs of CH-and MCT-induced PH rats．

Key words：pulmonary hypertension；chronic hypoxia；monocrotaline；notoginsenoside R1；store-operated cal-cium entry；pulmonary arterial smooth muscle cell

作者簡介：王瑞幸（1976－），男，博士，講師，研究方向：肺高壓致病機制，E-mail：wrx530＠163．com；戴 耄（1989－），男，碩士，研究方向：肺高壓致病機制，并列第一作者，E-mail：daimao890629＠163．com；林默君（1964－），男，博士，教授，研究方向：肺高壓致病機制，通訊作者，Tel：0591-22862429，E-mail：mjlin＠mail．fjmu．edu．cn

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 31171104，31371165，81400236）；福建省自然科學基金資助項目（No 2015J01313）

收稿日期：2015－06－18，修回日期：2015－07－06

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1463－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．027