脂聯素基因SNPs-11377C/G多態性與女性乳腺癌的相關性

宗成國,霍紅琳,張　婷,李紅敏

(大連大學附屬中山醫院 檢驗科,遼寧 大連116001)

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脂聯素基因SNPs-11377C/G多態性與女性乳腺癌的相關性

宗成國,霍紅琳,張婷,李紅敏

(大連大學附屬中山醫院 檢驗科,遼寧 大連116001)

摘要：目的探討脂聯素基因SNPs-11377C/G多態性與女性乳腺癌發生的相關性。方法用聚合酶鏈式反應-限制性內切酶長度多態性(PCR-RFLP)技術觀察脂聯素基因在不同人群中的單核苷酸多態性，其中包括乳腺癌組患者70人，健康對照組30人。結果SNPs-11377C/G等位基因頻率在乳腺癌和正常對照組間分布差異無統計學意義(P>0.05)，乳腺癌患者組CG基因型分布頻率高于GG型和對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。乳腺癌組CC基因型CA153與CEA表達水平高于對照組(P<0.05),差異有統計學意義。結論脂聯素基因啟動子區SNPs-11377C/G基因多態性與乳腺癌疾病發生有相關性。

(ChinJLabDiagn,2015,19:1071)

脂聯素(adiponectin，APN)是一種脂肪細胞特異性高分泌，具有多種功能的細胞因子，能提高組織對胰島素敏感性。血漿脂聯素水平可能與胰島素抵抗、肥胖、胰島素血癥呈負相關，另外也與乳腺癌負相關[1-3]。最近研究表明低循環的脂聯素水平與女性乳腺癌發病率提高密切相關，且與年齡、絕經情況、體質情況等無相關性。正常人脂聯素基因序列中存在相當數量的等位基因單核苷酸多態性(SNPs)，但這些密碼子的變化并不改變其編碼蛋白質的氨基酸序列。然而，脂聯素基因5′ 側翼區SNPs-11377C/G的變化，可能直接影響脂聯素的血漿水平[4]，進而影響女性乳腺癌等疾病的發生和發展。本研究采用PCR-RFLP技術分析脂聯素基因啟動子區SNPs-11377C/G基因型和等位基因頻率，旨在探討脂聯素基因啟動子區SNPs-11377C/G基因多態性與女性乳腺癌發生的相關性，為開展乳腺癌的基因診斷和基因治療提供理論依據。

1材料和方法

1.1研究對象來源于2011年至2012年我院普外科因乳腺癌住院患者及我院健康體檢者，分為乳腺癌組和正常對照組。① 乳腺癌組：70人，臨床已確診的乳腺癌患者。②正常對照組：30例，健康體檢者。

1.2　研究方法

1.2.1生化指標受試者于清晨空腹靜脈取血使用免疫分析儀檢測癌胚抗原(CEA)、CA153、CA125。

1.2.2脂聯素基因啟動子區SNPs-11377C/G基因型多態性的PCR-RFLP分析

①DNA的提取：取空腹靜脈血0.3 ml(EDTA抗凝)用全血DNA提取試劑盒(上海華舜公司)提取基因組DNA。 提取的基因組DNA，于-20℃保存備用。

②PCR擴增：從Genebank中查取人apM1基因序列，應用primer premier 5.0軟件設計引物，并由TaKaRa公司(大連)合成。

上游引物 5′ TGG TGG ACT TGA CTT TAC TGG TAG 3′ ；

下游引物 5′ TAG AAG CAG CCT GGA GAA CTG 3′。

PCR 反應體系(25 μl)):模板DNA1.5 μl，上下游引物各1.3 μl，2×Master Mix(TaKaRa大連公司) 12.5 μl，ddH2O 8.4 μl。

PCR反應條件：95℃預變性10 min，95℃ 變性1 min，61 ℃ 退火30 sec，72℃延伸1 min，共36個循環，完成后72℃ 維持10 min，擴增在PCR儀(Thermo公司)上完成。反應產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，產物片段為329 bp。

③酶切：用Hhal(TaKaRa公司)限制性內切酶酶切，37℃酶切水解4-16 h,取5 μl酶切產物置2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測酶切結果。

2結果

2.1　SNPs-11377C/G基因多態性3種酶切電泳結果(見圖1)

以人類基因組DNA為模版，目的基因脂聯素基因啟動子區SNPs-11377(C/G)擴增產物長度為329bp,此多態性位點可被限制性內切酶Hhal識別，酶切產物片段長度分別為CC(329bp)，CG(329bp;211bp;118bp),GG(211bp;118bp)。

圖1脂聯素基因啟動子區SNPs-11377(C/G)酶切電泳。(M：Marker;1、2、3、4、5、6、9：CC基因型；7、8、15、16：CG基因型；13、14：GG基因型)

2.2　SNPs-11377C/G基因型及等位基因頻率分布

以Hardy-Weinber平衡檢驗乳腺癌組和正常對照組的基因型頻率，等位基因的分布具有群體代表性(P>0.05)(見表1)。SNPs-11377C/G等位基因頻率在對照組和乳腺癌組兩組間分布差異無統計學意義(χ2=0.180；P=0.672)，但CG基因型與GG基因型相較，CG基因型在乳腺癌組的分布頻率高于GG基因型的分布頻率，且與對照組相比差異有統計學意義(χ2=5.649；P<0.05)，其他各基因型間差異無統計學意義(P>0.05)。

表1　乳腺癌組和對照組SNPs-11377C/G基因型及等位基因頻率分布

2.3　組間腫瘤標志物表達水平的比較

乳腺癌患者的CEA、CA153的均值明顯高于正常對照組(P<0.05)，差異有統計學意義(見表2)。

±s)

2.4　基因型分組臨床資料比較

在乳腺癌組和正常對照組中均以基因型分組，在對照組與乳腺癌組內，各基因型腫瘤標志物表達水平無顯著性差異，差異無統計學意義(P<0.05)。乳腺癌組CC基因型CEA表達水平高于對照組(P=0.0133)，CA153的表達水平高于對照組(P=0.0072),差異有統計學意義。

3討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約120萬女性發生乳腺癌。在我國大中城市中，乳腺癌的發病率已躍居女性惡性腫瘤的前兩位。

±s)

乳腺癌發生的高危因素和機制與肥胖、糖尿病、高血壓、高血脂等因素相關，乳腺癌為雌激素依賴性腫瘤，雌激素為細胞有絲分裂的刺激因子，可促進癌癥發生、發展。乳腺癌的早期診斷對降低乳腺癌的死亡率有著重要的意義。脂聯素在調節機體糖和脂肪代謝、維持機體能量代謝平衡中發揮著重要作用，且為基因表達過程中較為豐富的轉錄產物。脂聯素分泌失衡與糖、脂肪代謝異常相關疾病密切相關[1，5，6]，有報道認為，脂聯素還可能通過調節雌激素-胰島素水平參與乳腺癌的發生，低脂聯素可能改變激素與細胞因子的作用，從而增加了乳腺癌等腫瘤的發病率[6]，但具體機制目前尚不清楚。

正常人APN-1基因中存在相當數量的等位基因SNPs，且有較大頻率的基因多態性，但是密碼子的變化并不改變其編碼蛋白質的氨基酸的序列，染色體3q27區域同時存在2型糖尿病，代謝綜合征和冠心病的易感位點[7]，Gu[4]等人的研究表明脂聯素基因5′ 側翼區SNPs-11377C/G等變化可能直接影響脂聯素的血漿水平，可能與其改變了APN-1基因上游的某些轉錄元件有關[8]。Vasseur[9]等人不僅發現-11377C/G基因多態性與2型糖尿病相關，他們還發現SNPs-11391G/A或SNPs-11377C/G的基因型決定了糖尿病患者的脂聯素的水平。在我們的研究中，乳腺癌人群中-11377C/G的等位基因頻率(C=71.4，G=28.6)，與正常對照組無統計學意義(P<0.05)，與國外報道的正常人平均基因頻率接近[C=75.4，G=24.6(rs266729,NCBI)]，其原因可能與本研究排除糖尿病患者有關也可能與我們的樣本量較少有關。另外，在本研究中我們發現，與正常對照組相比，在乳腺癌患者中CG基因型分布頻率高于GG型，且差異有統計學意義，這提示我們，可能在人群中CG基因型對乳腺癌較GG基因型有較高易感性，說明脂聯素基因多態性與乳腺癌的發生有相關性。但要觀察其是否有普遍意義應加大樣本量，并觀察這兩組脂聯素的表達水平。

在本研究中，乳腺癌人群血脂指標明顯高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，葉楓[10]等研究結果顯示，脂聯素基因啟動子區SNPs-11377C/G的G等位基因可能是肥胖的易感基因之一，提示我們乳腺癌的發生、發展可能與肥胖有一定的相關性，且有研究發現GG基因型舒張壓，收縮壓，甘油三酯均有明顯增高趨勢。乳腺癌患者血清中CA153與CEA的表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，差異有統計學意義，CA153對乳癌有較好的敏感性和特異性，被認為是乳腺癌的首選腫瘤標志物，與乳腺癌的發生、發展具有密切的關系。乳腺癌患者血清CEA的表達水平明顯高于對照組(P<0.05)。在本研究中，我們發現乳腺癌患者SNPs-11377CC基因型的CA153與CEA的表達水平明顯高于對照組，提示，SNPs-11377CC型可能參與了乳腺癌的發展過程。

參考文獻：

[1]Takahata C,Mioshi Y,Irahara N,et al.Demonstration of adiponectin receptors I and mRNA expression in human breast cancer cells[J].Cancer Lett,2007,250(2):229.

[2]Dieudonne MN,Bussiere M,Dos Santos E,et al.Adiponectin mediates antiproliferative and apoptotic responses in human MCF7 breast cancer cell[J].Biochem Biophys Res Commun,2006，345(1):271.

[3]Mantzoros C,Petfdou E,Dessypris N,et al.Adiponectin and breast cancer risk[J].J Clin Endocrinol Metab JT,2004，89(3):1102.

[4]GU HF,Abulaiti A,Ostenson CG,et al.Single nucleotide polymorphisms in the proximal promoter region of the adiponectin(APM-1) gene are associated with type 2 diabetes in Swedish Caucasians[J].Diabetes,2004,53(Suppl 1):S31.

[5]Kadowaki T,Yamauchi T,Kubota N,et al.Adiponectin and adiponectin receptors in insulin resistance,disbetes,and the metabolic syndrome[J].J Clin invest，2006，116(7):1784.

[6]Kaaks R,Toniol O,Akhmedkhanov A,et al.Serum C-peptide,insulin-like growth factor(IGF)-1,IGF-binding proteins,and colorectal cancer risk in women[J].J Natl Cancer Inst,2000,92:1592.

[7]Francke S,Manraj M,Lacquemant C,et al.A genome wide scan for coronary Heart disease suggests in Indo-Mauritians a susceptibility locous chromosome 16p13 and replicates linkage with the metabolic syndromeon3827[J].Hum Mol Genet,2001,10:2751.

[8]Schwarz PE,Govindarajalu S,Towers W,et al.Hypoadiponectinemia is in the ADIPOQ gene promoter[J].Diabetes Care,2006,29(7):1645.

[9]Vasseur F,Helbecque N,Dina C,et al.Single-nucleotide polymorphism haplotypes in the both proximal Promoter and exon3 of the APMI gene modulate adipoeyte-secreted adiponectin Hormone levels and contribute to the genetic risk for type 2 diabetes in French Caucasians [J].Human Molecular Genetics,2002,11(21):2607.

[10]葉楓,何嵐,李建寧,等,脂聯素基因啟動子區多態性與肥胖、2型糖尿病的相關性[J].西安交通大學學報,2008,29(1):74.

關鍵詞：乳腺癌；脂聯素；基因多態性

Association of SNPs-11377C/G in proximal promoter region of adiponectin gene with breast cancer for femaleZONGCheng-guo,HUOHong-lin,ZHANGTing,etal.(ZhongshanHospitalAffiliatedtoDalianUniversity,Dalian116001,China)

Abstract:ObjectiveTo study the association of SNPs-11377C/G in proximal promoter region of adiponectin gene with breast cancer for female.MethodsThe PCR-RFLP techniques were adopted to test SNPs in the proximal promoter region of the APM1 gene in 30 normal control group and 70 breast cancer group.ResultsThere were no significant difference of the distribution of the Gensini coronary scores in the two groups(P>0.05).The frequencies of CG were higher than GG in breast cancer compared with normal.In breast cancer group,serum CA153 and CEA level of GG genotype and CC genotype at position-11377 were significantly higher than in control group(P<0.05).ConclusionThe results suggest that SNPs-11377C/G in proximal promoter region of adiponectin gene may contribute to the risk of breast cancer for female.

Key words:breast cancer；adiponectin；gene polymorphism

(收稿日期：2014-05-26)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R737.9

文章編號：1007-4287(2015)07-1071-03