脫細胞真皮基質血管化研究進展

林夢媛綜述，夏德林審校

(瀘州醫學院附屬口腔醫院頜面外科，四川瀘州646000)

脫細胞真皮基質血管化研究進展

林夢媛綜述，夏德林審校

(瀘州醫學院附屬口腔醫院頜面外科，四川瀘州646000)

組織創傷及缺損常常導致器官功能障礙和外形破壞，精確的修復重建在未來仍將是一個重大的醫療問題。20世紀90年代，脫細胞真皮基質(acellular dermal matrix，ADM)首次成功用于皮膚缺損的修復，隨后被迅速推廣于臨床[1，2]。但是ADM僅是一種皮膚替代品，與真正的活體皮膚在結構和功能上有非常大的差異。ADM移植后可減少瘢痕形成與色素沉著，改善受皮區創面愈合后的柔韌性和彈性。但與自體皮膚移植相比，真皮替代物的血管化進程仍明顯偏慢，大大限制了ADM的臨床應用。在治療較大面積的皮膚缺損和深度損傷時，血供問題常常導致治療失敗[3]。因此，早期、快速血管化是ADM在整復外科領域中實現更好發展的保障。本文就ADM的血管化研究現狀做一綜述。

1 ADM的結構特點

ADM是指用化學或物理方法去除皮膚的表皮成分（角質細胞，汗腺，皮脂腺）和真皮成分（成纖維細胞，血管內皮細胞，平滑肌細胞）后，保留真皮內的細胞外基質,維持完整的膠原形態和基底膜的一種真皮替代物。因此其基本成分主要包括細胞外基質、彈性蛋白、膠原成分（Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、Ⅶ型膠原）和極少量的細胞相關抗原（包括HLAABC、HLA-DR、Vimentin、Desmin、Talin等）[4]。

目前，ADM的制備方法主要有三類：①生物學酶（胰蛋白酶，中性蛋白酶和核酸酶等）消化法;②物理學的反復凍融法（利用組織內源性酶）;③化學去污劑法（SDS,EDTA,Triton-100等）或高滲鹽法[5]。大量研究認為ADM植入活體后，成纖維細胞的黏附生長與殘存的基底膜結構有密切關系，所以在ADM制作過程中，盡可能完整地保留基底膜。ADM的基底膜復合物可以形成基底膜與真皮兩個面，基底膜面可誘導上皮細胞的移行和定植，有利于ADM的上皮化，真皮面有利于快速血管化。同時，ADM中疏松有序的膠原結構能誘導宿主細胞的良性遷移，最終完成受損組織的重構。體外實驗也發現，有序的膠原結構能促進血管內皮細胞黏附，從而促進血管生長。

2 ADM的血管化研究

ADM血管化速率主要取決于移植早期能否及時獲得血漿、組織滲液的營養供應，使周圍的內皮細胞、成纖維細胞、淋巴細胞等其它細胞因子能及時長入。由于ADM去除了皮脂腺、毛發、血管、汗腺成分，具有密集的孔隙，因此植入宿主體內后，血管內皮能較快滲透進去，從而實現血管化，為周圍自體皮或自體細胞生長提供充足的營養，這是ADM相比其它同類材料最大的優勢。Kristin等[6]通過在幾內亞豬腹部人為制造腹部切口疝，然后分別用人脫細胞真皮基質(Human acellular dermal matrix,HADM)和豬脫細胞真皮基質(porcine acellular dermal matrix，PADM)修復切口疝，結果發現HADM比PADM更容易與活體組織融合生長，其主要原因是在移植后，前者的血管化及細胞滲透速度更快。目前ADM的血管化研究主要分為以下幾方面。

2.1 ADM的物理特性對血管化的影響

ADM孔隙的大小、密度不規則。掃描電鏡下呈現出凹凸不平的非連續腔隙結構，此結構是其移植早期獲得血漿、組織滲液以及其他營養因子的基礎。由于ADM是加工處理而成的真皮替代產品，其孔徑的大小與活體真皮存在差異[7]。因此，其孔徑和間距分別為多大時才最有利于血管化和組織修復，目前尚無統一結論。Burke等在膠原—氨基葡聚糖(glycosaminoglycan，GAG)膜上種植表皮細胞發現，真皮支架表面孔徑小于培養細胞直徑(15～20 μm)，更有利于細胞生長、分化。但之后的研究結論與此相反，Pruitt等[8]認為只有ADM孔徑大于80 μm以后，周圍組織的內皮細胞、淋巴細胞以及生長因子才能順利滲透進入ADM，從而實現血管化。但有一點是被公認的：ADM越薄，組織液越容易滲透進去，從而促進血管化，反之則阻礙ADM血管化。目前商品化的ADM厚度多為0.2 mm，多數認為在移植時自體皮片加ADM的總厚度不超過0.7 mm更有利于移植成活。

2.2 促血管生長因子對ADM血管化的影響

血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種非常強效的內皮細胞有絲分裂促進劑，具有極強的促進血管增生的能力，可刺激內皮細胞在體外形成血管樣結構。VEGF有多種同型異構體，其中主要有VEGF 121、VEGF 165、VEGF 145、VEGF189、VEGF206等。各種VEGF異構體都具有促進血管再生的能力，其中VEGF165促進血管再生的能力最強，在組織工程組織血管化過程中被廣泛應用。

李菲菲等[9]將胎兒ADM包埋在SD大鼠背部皮下，實驗組在包埋區皮下滴加血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），空白組只做ADM包埋，在術后不同時間點分別取材，通過免疫組織化學方法，發現在術后6周，實驗組血管密度明顯高于空白組，預示了VEGF能在宿主體內促進ADM的血管化，具有潛在的應用價值。賀立新等[10]通過體外實驗，將VEGF165基因轉染到鼠成纖維細胞后，再把此成纖維細胞接種于異種ADM表面，然后用10%的小牛血清體外培養1周，形成成纖維細胞—ADM的真皮替代物。在SD大鼠背部切取3 cm×4 cm的全厚皮片，將成纖維細胞一異種脫細胞真皮埋植在皮片缺損區，然后將皮片覆蓋在成纖維細胞異種脫細胞真皮表面，術后不同時間點觀察術區愈合情況。結果發現：與對照組相比，成纖維細胞—ADM提高了皮片成活率，術后第4周可見實驗組異種脫細胞真皮結構中毛細血管數量明顯多于對照組。類似實驗，通過手術，在豚鼠背部造成2 cm×2 cm的全層皮膚缺損區域，然后植入ADM，表面覆蓋自體斷層皮片并縫合，在ADM深面注射囊化VEGF165—NIH3T3細胞，術后兩周，通過免疫組化方法發現實驗組微血管密度明顯高于對照組，實驗組皮片成活率明顯提高[11]。這些結果都說明了VEGF在促進ADM血管化方面有顯著效果。

堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)屬于FGF家族(23個已知成員)，是一種肝素結合生長因子。能夠促進包括間葉細胞和血管內皮細胞在內的一系列細胞的增殖，刺激成纖維細胞和毛細血管內皮管腔的形成，在體內具有潛在的促血管生成活性。Tepper等[12]在體內和體外實驗中利用電磁場的作用促進內皮細胞分泌出bFGF,實驗結果顯示bFGF能促進血管生長和形成。此外，bFGF在傷口愈合和組織修復中發揮著重要。但是目前還未見bFGF運用在ADM的相關研究。

2.3 血管化種子細胞對ADM血管化的影響

內皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC)和血管內皮細胞是最終分化為血管的主要細胞[13,14]。研究認為，能分化為血管的EPC表面標記物主要有CD31，CD34,Tie-2。在正常情況下EPC保持低增殖活性，在組織損傷后，EPC能分化形成血管等新的組織結構。進入循環系統中的內皮祖細胞(circulating endothelial progenitor,CEP)具有較高的增殖潛能，研究證實，在四肢缺血、心肌缺血，視網膜缺血以及胰腺缺血后，體內應用CEP能有效促進損傷區血管生長[15-17]。因此，ECP和CEP在組織工程血管化方面的應用具有潛在價值，但目前沒有將二者用于ADM的相關報道。

早在1998年，Black等[18]將人臍靜脈內皮細胞和真皮成纖維細胞培養在膠原粘多糖（collagen-glycosaminoglycan）高分子聚合物支架上，成功誘導支架內皮化。隨后，Supp等[3]通過基因改造，讓角質細胞高表達血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）后，將其種植在皮膚替代物表面，然后將皮膚替代物移植在裸鼠皮下，結果顯示其促進了皮膚替代物血管化。為了解決異體細胞引起的排斥反應，Sahota等[19]從需要皮膚修復手術的患者體表取下少量皮膚組織，運用膠原酶消化法分離出微血管內皮細胞（human dermal microvascular endothelial cells，HuDMECs）、角化細胞、成纖維細胞后，在體外環境中讓三者同時生長黏附在人ADM材料上，形成ADM復合物，然后將ADM復合物進行自體移植。通過觀察發現：在體外培養2周左右，HuDMECs滲透入ADM的量最合適，即適合移植入活體，術后隨訪發現移植的ADM復合物生長良好，修復效果滿意。將人內皮細胞單獨培養在二維培養基中，容易喪失其分化潛能，為了觀察內皮細胞早期管狀出芽情況，Wenger等[20]將人臍靜脈內皮細胞和成骨細胞混合培養于膠原支架上，使其生長形成類球體，最終誘導出新生血管，使膠原支架血管化。2003年王軍琳等[21]通過在ADM材料上培養人血管內皮細胞加速了ADM血管化。汪道新等[22]通過實驗，在豬的背側剃毛后，切除皮膚全層，手術造成大小為5 cm×5 cm的圓形皮膚缺損區域，然后植入ADM，在ADM下方注射人臍靜脈內皮細胞懸液1 mL，約含細胞2×106個，其上覆蓋自體皮膚后封閉傷口，術后7 d發現術區血管化數目明顯多于對照組。楊家驥等[23]用人臍靜脈內皮細胞復合豬ADM構建出富含血管化結構的真皮替代物，然后移植在裸鼠皮下，移植后3周，HE結果顯示，對照組無血管形成，而實驗組有大量血管樣結構形成。臍靜脈血管內皮細胞和成纖維細胞共培養在ADM材料上，制成ADM復合物，然后移植在裸鼠背部皮膚下，作者用自制的極低頻電磁刺激儀分別在體外、體內實驗兩個階段刺激ADM復合物上面的細胞，結果發現極低頻電磁場不僅促進成纖維細胞和血管內皮細胞共培養體系形成血管結構，并且促進與宿主血管相吻合。因此，在體外構建出由ADM復合人臍靜脈內皮細胞含血管樣結構的組織工程真皮，能在移植進入動物體內后提高修復區組織的血管形成速度，進而提高移植成功率，極低頻電磁場能有效促進這一過程[24]。雖然這類方法目前取得了一定進展，但是血管內皮細胞在支架材料上存活較低、易凋亡，因此，仍然需要進一步探索更為有效的ADM血管化方法。

3 展望

脫細胞真皮基質在臨床應用中，其內部結構血管化是ADM移植是否成活的關鍵。因此，充分理解ADM在體內、體外血管化的具體機制，有利于進一步探索新的促進ADM血管化的策略，提高它在活體移植的成功率。雖然ADM已經廣泛應用于臨床，但它畢竟是一種缺乏活體細胞的真皮替代產品，要實現與活體組織的完美融合，甚至實現活體皮膚的功能，仍然有很多問題需要解決。首先應該進一步探索材料的孔徑大小及孔徑密度，以使血管化達到最佳。同時優化ADM的制作方法、開發新的打孔技術，使材料的物理特性和生物學特性更符合血管化要求。第二方面，進一步探索ADM血管化的分子機制，尋找新的蛋白或基因調控靶點，從而建立新的促血管化方法。除此之外，3D生物打印技術是目前新興的學科，根據已有報道，它已經成功應用于修復外科領域，特別是骨骼、皮膚修復方面[25-27]。應用這個手段，結合細胞生物技術、高分子材料技術，將來可能會在組織修復，包括ADM血管化方面有所突破[28]。本文通過歸納目前實現ADM血管化的主要方法和相應進展，旨在為ADM血管化相關研究提供線索和思路。

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（2014-10-10收稿）

R783.9

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.02.030

林夢媛（1987-），女，住院醫師，碩士研究生，E-mail：497313477@qq.com