探索顱內出血細胞及分子學發病機理

康 婕，李小剛

(瀘州醫學院附屬醫院，四川 瀘州 646000)

顱內出血(intracranial hemorrhage，ICH)是一種血液滲入腦組織，形成血腫，導致病理性水腫和腦組織損傷的急性卒中，ICH約占卒中的15%，現在尚無令人滿意的治療方法。ICH后持續的功能失常，使患者死亡率高，預后差。此外，ICH后出現腦梗死后出血轉化，進一步加重腦損傷和神經系統癥狀。ICH的實驗動物模型主要以注入膠原酶或自體血到腦實質為基礎，以助于了解ICH復雜的發病機理。現就ICH發病的細胞及分子機理、研究中存在的問題做一綜述。

1 ICH發病的分子學機理

ICH后血腫形成，導致腦組織損傷。凝血酶、血紅蛋白A及其降解產物對腦細胞產生生物作用和毒性作用，它們是ICH發病的重要因素。這些反應主要是由血液外滲造成的，然后引發腦實質的次級反應，比如附加蛋白酶的補充、炎性反應和固有的細胞保護系統。

1.1 凝血酶及其受體的作用 凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，在凝血級聯系統中起關鍵作用。凝血酶參與大腦內多種生理作用和病理過程。ICH后，血液在凝固過程中產生的大量凝血酶具有細胞毒性作用，是出血后一系列病理生理變化而致繼發性腦損傷的關鍵物質［1］。研究發現，在大鼠紋狀體注射全血誘發的水腫，能被凝血酶抑制劑水蛭素抑制。其機理包括:(1)抑制凝血酶誘導的水通道蛋白(aquaporin，AQP)中AQP－4和AQP－9的表達;(2)抑制基質金屬蛋白酶－9(matrix metalloproteinase－9，MMP－9)表達，減輕血 －腦屏障(blood brain barrier，BBB)破壞，降低血管通透性;(3)抑制神經膠質細胞浸潤，減輕其引起的腦組織損害［2］。ICH相關性水腫是BBB破壞和腦實質細胞死亡導致的，而它們可能由凝血酶誘發。

凝血酶受體是一種蛋白酶激活受體(protease activated receptors，PAR)，ICH 后 PAR －1在凝血酶介導的神經細胞損傷中起主要作用。ICH后，凝血酶會持續性產生，PAR－1的表達高峰與細胞凋亡和腦水腫的高峰一致，均在ICH 72 h左右，提示PAR－1參與了ICH后腦損傷的全過程［3］。PAR－1活化后激活細胞內多個信號傳導通路，如激活RhoA、蛋白激酶C、絲裂原激活蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)，激活核內蛋白合成酶的表達，促進細胞凋亡蛋白的表達和釋放，加重腦水腫和繼發性腦損傷［4－5］。

大腦皮質和紋狀體之間損傷機理存在明顯差別。例如，胞外信號調節激酶(extracellular signalregulated kinases，ERK)、p38 和 JNK，是 MAPK 家族的3種成員，它們都參與凝血酶誘導的紋狀體損傷，而在凝血酶誘導腦皮質損傷過程中，只有ERK參與。此外，來自于切片培養的小膠質細胞的損耗，能減輕凝血酶誘導紋狀體組織損傷，卻不能對皮質細胞起到這一作用，說明小膠質細胞只參與紋狀體組織損傷這個過程［6］。另一方面，血纖維蛋白溶酶原被發現能與凝血酶共同作用誘導皮質損傷，而在凝血酶誘導紋狀體損傷中未發現這一現象［7］。

凝血酶介導的細胞損傷同樣能被活化的MMP－9介導。同時作用的MMP－9能加劇原始培養中神經細胞的凝血酶的細胞毒性，MMP抑制劑能部分性減弱凝血酶的細胞毒性。另外，MMP－9編碼基因缺失和凝血酶抑制劑水蛭素的應用，兩者協同作用，能減弱自體血注入誘導的腦損傷。

1.2 基質金屬蛋白酶的作用 MMP在細胞表面調節細胞間的信號傳遞。MMP未活化時主要存在于細胞質內，參與蛋白質的裂解［8］，甚至能進入細胞核，影響基因轉錄和DNA修復［9］，參與組織結構的重塑。病理條件下，MMP活化后可降解細胞外基質，造成組織損傷。ICH后，MMP家族的不同成員聚集并參與這一發病過程。有研究發現，MMP抑制劑BB－1101能在誘發ICH 6 h后減輕腦水腫。在ICH后，MMP－9和MMP－3的表達隨之增加［10］。MMP－9的升高與腦水腫范圍有關，而MMP－3與高死亡率相關［10］。使用缺失MMP－9大鼠的實驗證明MMP－9參與了注射自體血后水腫的形成。此外，與野生型大鼠相比，缺失MMP－9大鼠表現更低水平的神經變性，中性粒細胞浸潤和小膠質細胞/巨噬細胞反應。膠原酶注入模型中發現，MMP－9主要表達在神經元和血管內皮細胞，在誘導ICH后最初2 h，給予MMP抑制劑GM6001，能減輕中性粒細胞浸潤、氧化應激、腦水腫、神經變性和神經功能缺損［11］。有證據表明，MMP－12在大鼠和小鼠膠原酶注入模型中顯著表達，MMP－12缺失小鼠在ICH后表現出更好的功能恢復，在水腫區域小膠質細胞/巨噬細胞反應水平更低［12］，MMP－12也許在ICH的發病機理中起關鍵作用。

然而，不同研究卻得到相反結論。例如，一個關于MMP－9缺失小鼠的研究表明，膠原酶注入突變小鼠的紋狀體導致出血增加，死亡率增高，神經功能缺失加重。這些變化也許可以歸咎于ICH后MMP－2和MMP－3反應性增加，以及MMP－9缺失小鼠大腦中膠原水平下降［13］。另外，在膠原酶注入前30min，將廣譜性MMP抑制劑BB－94通過全身性用藥，會使出血量和DNA斷裂的細胞數增加。

1.3 亞鐵血紅素和鐵的作用 血紅蛋白和它的降解產物，也參與ICH的發病過程。ICH發生后，大量紅細胞滲入腦實質，但溶血反應不會立即發生，而是在出血后數天甚至數周后發生。紅細胞溶解釋放產生血紅蛋白，血紅蛋白釋放亞鐵血紅素，然后亞鐵血紅素和血紅蛋白被類似神經元和膠質細胞的腦實質細胞替代。

亞鐵血紅素能被血紅素氧化酶(HO)降解成膽綠素、鐵和一氧化碳(CO)，亞鐵血紅素或它的降解產物促進腦水腫的形成。HO的主要亞型是HO－1和HO－2。在注射膠原酶或自體血誘導ICH后，HO－1被誘導顯著表達在小膠質細胞/巨噬細胞和內皮細胞［14］。切除HO－1基因能減輕ICH相關性損傷程度、中性粒細胞浸潤、小膠質細胞/巨噬細胞活化和氧活性損傷［15］。

鐵由亞鐵血紅素降解產生，通過加速氧化應激反應在ICH發病機理中起關鍵作用。研究顯示，高血清鐵蛋白水平與ICH患者預后不良有關，說明鐵參與ICH引起的腦組織損傷［16］。非蛋白結合鐵能通過介導生成大量自由基直接破壞或通過NO、MMP、炎性細胞因子等間接破壞 BBB，從而導致血管源性腦水腫［17］。另外，產生的大量自由基通過破壞細胞膜離子轉運體、誘發興奮性氨基酸過量生成、細胞內Ca2+超載、酸中毒等機理導致細胞毒性腦水腫［18］。研究還提示鐵螯合劑－去鐵胺能減輕組織損傷和神經功能缺損。然而，去鐵胺的作用功效取決于ICH模型的類型。提出去鐵胺有效作用的報道都以自體血注入模型為基礎，去鐵胺并不能改善膠原酶注入誘導型ICH模型大鼠的預后。

1.4 促炎性細胞因子和其他 ICH發病機理中包括多種炎性反應，如小膠質細胞活化、中性粒細胞浸潤、氧化應激反應增多和促炎性細胞因子產物。注射自體血或凝血酶到紋狀體以及膠原酶誘導型ICH時，腫瘤壞死因子α(TNF－α)表達水平均升高。ICH導致急性占位性損傷，激發免疫系統表達TNF－α增加，促進中性粒細胞向病灶區聚集，誘導白細胞、受損組織細胞釋放更多的細胞因子，促使白細胞自血管內向缺血區腦組織遷移，加重腦組織損傷。

ICAM－1是白細胞表面白細胞功能相關抗原－1(lymphocyte function－associated antigen－1，LFA －1)的配體，參與白細胞黏附和活化，在免疫炎性反應中發揮重要介導作用［19］。ICAM－1和LFA－1結合可發揮多種生物學作用，參與炎癥反應、免疫應答和調節細胞凋亡，參與中性粒細胞與內皮細胞黏附、白細胞穿出血管壁。正常情況下，ICAM－1在血管內皮細胞低水平表達，當組織缺血受損或炎癥反應時表達增強，產生多種生理和病理反應［20］。

IL－6對單核巨噬細胞有趨化作用，引起腦血腫周圍缺血區單核巨噬細胞的增多。浸入的白細胞激活蛋白酶引起自由基誘發脂質過氧化，導致神經元損傷。IL－6通過使興奮性氨基酸釋放增多并作用于中性粒細胞、巨噬細胞和血管內皮細胞誘導NO合成酶的表達，使NO合成增多，刺激花生四烯酸的代謝，使自由基釋放增加，破壞血管內皮細胞的緊密聯接，使血管壁通透性增加而導致腦水腫形成［21］。但同時，IL－6能下調IL－1和TNF－α合成，發揮抗炎作用，能潛在起著避免炎癥反應的過度破壞作用。因此，過高的IL－6對腦組織具有毒性作用還是具有保護作用目前尚存爭議［22－23］。

2 相關治療藥物研究

目前研究的ICH治療藥物，大多具有抗氧化作用、抗炎性、神經營養和神經保護作用，其中部分已被用于其他神經系統疾病的治療。這些藥物雖然在動物模型上被證明有效，但在ICH臨床治療上的有效性和安全性尚不清楚。此外，干細胞及其衍生細胞也被用于ICH后神經功能缺損的治療。干細胞通過抗炎能力表現出對神經功能恢復有利的免疫調節功能，但神經炎癥反應發揮著既可能有益又可能有害的作用。如何促進炎癥在干細胞神經發生中的有益效應并減少或抑制其不良效應，采取適當措施來指導和誘導炎癥向需要的方向發展，仍然需要得到解決。

3 展 望

ICH發病的機理尚未完全研究透徹。在ICH模型和患者中，數百種基因表達水平上調或者下調，參與炎性反應、新陳代謝、神經元信號傳遞。研究清楚這些基因的產物在ICH發病機理中的作用，能為ICH找到治療方案提供幫助。

從實驗研究上看，能改善ICH病理學和神經病學預后的藥物越來越多。但是，這些藥物在ICH患者治療中是否有效仍屬未知。在ICH發生之后，自體修復過程會啟動，取代損傷過程，藥物治療是否會對此過程產生影響也不得而知。例如，蛋白激酶Src的抑制作用能改善自體血注射后大鼠的急性期預后情況，如神經功能障礙和行為異常。同時，ICH模型中Src持續的抑制作用卻會影響神經及血管的修復過程，妨礙BBB形成，這也許會導致遠期預后不良。

ICH后的神經學癥狀的嚴重程度與白質損傷范圍緊密相關，從臨床治療的角度上來說，ICH治療中最重要的問題是降低死亡率和減輕神經功能缺損，但目前大部分研究主要關心的是神經元的缺失，對白質損傷缺乏關注。目前常用的ICH試驗動物模型為紋狀體自體血注射和膠原酶注射。前者不是自發性和連續性出血，這與人類腦出血患者有所區別。后者會加重膠原引起的炎癥反應和神經毒性。這兩種方法結構損傷部位和程度、神經損害評估方法不同，預后特點也不同，都無法完全模擬人類ICH的真實情況。所以，如何了解不同模型的優勢和劣勢，最大程度上接近人類ICH情況，將動物實驗轉化為臨床治療，至關重要。ICH動物模型研究，需要一些便于推測到臨床表現的精細的實驗結論。

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