骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)廢用性骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs成脂分化的影響及機(jī)制探討

高俊，胡繼紅，張曦(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州醫(yī)院，江蘇常州3003;常州市第二人民醫(yī)院)

骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)廢用性骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs成脂分化的影響及機(jī)制探討

高俊1，胡繼紅2，張曦1
(1南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州醫(yī)院，江蘇常州213003;2常州市第二人民醫(yī)院)

摘要:目的觀察骨碎補(bǔ)總黃酮含藥血清對(duì)廢用性骨質(zhì)疏松大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成脂分化的影響，并探討其可能機(jī)制。方法57只SD雌性大鼠均制備廢用性骨質(zhì)疏松模型，制模成功后將實(shí)驗(yàn)大鼠分為4組。A組12只，不加任何干預(yù); B組15只，術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)4周，后以辛伐他汀灌胃6周制備含藥血清; C組15只，術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)4周，后以低劑量骨碎補(bǔ)總黃酮灌胃6周制備含藥血清(相當(dāng)于臨床劑量的5倍);d組15只，術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)4周，后以高劑量骨碎補(bǔ)總黃酮灌胃6周制備含藥血清(相當(dāng)于臨床劑量的20倍)。大鼠用頸椎脫臼法處死，取原代BMSCs，并進(jìn)行體外培養(yǎng)、傳代和純化，觀察各組成脂油紅染色情況，比較各組Wnt信號(hào)分子(Wnt3a)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(LRP6)、過氧化物酶體增殖物激治受體(PPAR)γ2mRNA和蛋白。結(jié)果A、B、C、D組成脂油紅染色OD值分別為0.216 333±0.010、0.165 667±0.012、0.152 333±0.010、0.168 667±0.008，A組分別與B、C、D組比較，P均＜0.05。A組Wnt3a、LRP6、PPARγ2mRNA分別為1.00±0.23、1.00±0.13、1.00±0.15，B組分別為3.71±0.25、3.47±0.18、0.46±0.21，C組分別為3.38±0.21、2.83±0.45、0.42±0.34，D組分別為2.98± 1.11、2.81±0.07、0.35±0.12，A組分別與B、C、D組比較，P均＜0.05。A、B、C、D組Wnt3a蛋白分別為0.49± 0.14、0.72±0.11、0.75±0.10、0.78±0.15，A組分別與B、C、D組比較，P均＜0.05; LRP6蛋白分別為0.62±0.19、0.95±0.16、1.07±0.23、1.12±0.25，A組分別與B、C、D組比較，P均＜0.05; PPARγ2蛋白分別為0.30±0.04、0.27±0.06、0.48±0.08、0.45±0.09，A、B組分別與C、D組比較，P均＜0.05。。結(jié)論骨碎補(bǔ)總黃酮可抑制廢用性骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs成脂分化，其機(jī)制可能為上調(diào)Wnt3a、LRP6表達(dá)水平，并抑制PPARγ2表達(dá)。

關(guān)鍵詞:廢用性骨質(zhì)疏松;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;成脂分化;過氧化物酶體增殖物激活受體;動(dòng)物試驗(yàn)

廢用性骨質(zhì)疏松癥臨床上常見，多見于長期臥床、運(yùn)動(dòng)功能受限和長期制動(dòng)，該疾病已經(jīng)成為骨創(chuàng)傷疾病、骨關(guān)節(jié)疾病及骨關(guān)節(jié)疾病術(shù)后康復(fù)的重要障礙，甚至有發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)，影響原發(fā)疾病的治療和康復(fù)。經(jīng)過長期實(shí)踐，確立了“腎主骨”的理論，并以“治未病”、“辨證施治”和“標(biāo)本兼治”等整體治療觀為指導(dǎo)思想，在防治繼發(fā)骨質(zhì)疏松中得到廣泛認(rèn)同［1］。我們前期研究［2，3］表明，骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)廢用性骨質(zhì)疏松大鼠血堿性磷酸酶、血清骨鈣素、抗酒石酸酸性磷酸酶、尿羥脯氨酸/尿肌酐、骨小梁節(jié)點(diǎn)數(shù)、游離末端數(shù)及股骨生物力學(xué)指標(biāo)有不同程度改善作用，能促進(jìn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2表達(dá)，表明骨碎補(bǔ)總黃酮有不同程度的成骨作用，可不同程度延緩或減輕大鼠廢用性骨質(zhì)疏松的發(fā)生。本研究觀察了骨碎補(bǔ)總黃酮含藥血清對(duì)廢用性骨質(zhì)疏松大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成脂分化的影響，并探討其可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康未生育3月齡SD雌性大鼠57

只，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號(hào): SCXK(蘇2009-0002)，發(fā)證機(jī)關(guān):江蘇省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)。

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1.2主要藥物及試劑強(qiáng)骨膠囊:購自北京歧黃制藥有限公司，每粒膠囊0.25 g，含骨碎補(bǔ)總黃酮有效成份0.18 g。10%胎牛血清，低糖DMEM培養(yǎng)液; L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤; EsyPure RNA Kit、TRIzol、Trants2KdNAmarkerdL2000、TaKaRa RNA PCR Kit Ver 3.0試劑盒; 10%甲醛，油紅，99%異丙醇，60%異丙醇，蘇木精，磷酸鹽緩沖液，四甲基乙二胺，麗春紅染液，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ2引物。

1.3廢用性骨質(zhì)疏松模型制備及骨碎補(bǔ)總黃酮干預(yù)所有大鼠用10%水合氯醛(3mL/100 g)行腹腔麻醉，后暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，于近髖處用銳利刀片切除坐骨神經(jīng)，長約5mm，并將神經(jīng)斷端打結(jié)處理，逐層縫合切口［4］。肌注慶大霉素0.1mL，以預(yù)防感染。將實(shí)驗(yàn)大鼠分為4組。A組12只，不加任何干預(yù); B組15只，術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)4周，后以辛伐他汀灌胃6周制備含藥血清; C組15只，術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)4周，后以低劑量骨碎補(bǔ)總黃酮灌胃6周制備含藥血清(相當(dāng)于臨床劑量的5倍);d組15只，術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)4周，后以高劑量骨碎補(bǔ)總黃酮灌胃6周制備含藥血清(相當(dāng)于臨床劑量的20倍)。

1.4原代BMSCs的體外培養(yǎng)A、B、C、D組大鼠用頸椎脫臼法處死，無菌條件下分離出大鼠股骨，放入盛有PBS液平皿中，剔除附著的肌肉等組織，將股骨中間剪斷，用注射器吸取低糖DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，以沖出骨髓，并制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液離心(1 500 r/min，10min)，棄上清。加入含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，吹打散細(xì)胞。計(jì)數(shù)細(xì)胞并以1.07×102/mL的密度接種在培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5大鼠BMSCs的傳代和純化利用差異貼壁培養(yǎng)法純化細(xì)胞。傳代:加MSCs消化液(0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA液)，在倒置顯微鏡下觀察，至細(xì)胞間間隙增大、細(xì)胞變圓并開始脫落加入等量完全培養(yǎng)基終止消化，吹打瓶底，離心機(jī)離心(1 500 r/min，10min)，去上清，加入培養(yǎng)基，吹打散細(xì)胞，按1∶3傳代，消化5～15min，傳代細(xì)胞1～3min。

1.6油紅染色觀察用10%甲醛固定，再用60%異丙醇稍洗切片。經(jīng)過10min油紅O液染色后用60%異丙醇漂洗殘余染液。清洗多余水分上甘油明膠封固。

1.7 Wnt信號(hào)分子(Wnt3a)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(LRP6)、PPARγ2mRNA檢測采用

RT-PCR法。采用TRIzol法提取總RNA，將RTPCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外凝膠成像系統(tǒng)上照相，并記錄下每條DNA擴(kuò)增帶的灰度值。

1.8 Wnt3a、LRP6、PPARγ2蛋白檢測采用Western blotting法。清洗玻璃板，灌膠與上樣后行SDSPAGE電泳。然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和抗體的孵育，顯影后在凝膠圖像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。采用Image J軟件測定灰度值(以β-actin內(nèi)參為基準(zhǔn))，每個(gè)數(shù)據(jù)測定3次取平均值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組成脂油紅染色比較成脂誘導(dǎo)14d后各組BMSCs分化情況見圖1。A、B、C、D組成脂油紅染色OD值分別為0.216 333±0.010、0.165 667± 0.012、0.152 333±0.010、0.168 667±0.008，A組分別與B、C、D組比較，P均＜0.05。

圖1　成脂誘導(dǎo)圖14d后各組BMSCs分化情況(圖100×)

2.2各組Wnt3a、LRP6、PPARγ2mRNA表達(dá)比較結(jié)果見表1。

表1　各組Wnt3a、LRP6、PPARγ2mRNA表達(dá)比較()

表1　各組Wnt3a、LRP6、PPARγ2mRNA表達(dá)比較()

注:與A組比較，*P＜0.05。

組別　Wnt3amRNA　LRP6mRNA　PPARγ2mRNA A組1.00±0.23　1.00±0.13　1.00±0.15 B組　3.71±0.25*　3.47±0.18*　0.46±0.21*C組　3.38±0.21*　2.83±0.45*　0.42±0.34*d組　2.98±1.11*　2.81±0.07*　0.35±0.12*

2.3各組Wnt3a、LRP6、PPARγ2蛋白表達(dá)比較結(jié)果見表2。

表2　各組Wnt3a、LRP6、PPARγ2蛋白表達(dá)比較()

表2　各組Wnt3a、LRP6、PPARγ2蛋白表達(dá)比較()

注:與A組比較，*P＜0.05;與B組比較，△P＜0.05。

組別　Wnt3a蛋白　LRP6蛋白　PPARγ2蛋白A組0.49±0.14　0.62±0.19　0.30±0.04 B組　0.72±0.11*　0.95±0.16*　0.27±0.06 C組　0.75±0.10*　1.07±0.23*　0.48±0.08＊△D組　0.78±0.15*　1.12±0.25*　0.45±0.09＊△

3　討論

BMSCs具有干細(xì)胞的共性，即具有自我復(fù)制和多向分化能力［5］。體外不同誘導(dǎo)條件下，BMSCs能夠向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞等不同的細(xì)胞系分化［6］。體外實(shí)驗(yàn)研究［7］發(fā)現(xiàn)，在BMSCs與不同濃度的脂肪細(xì)胞的共培育體系中，隨著脂肪細(xì)胞濃度上升，BMSCs內(nèi)堿性磷酸酶相對(duì)活性下降。由此認(rèn)為髓內(nèi)脂肪細(xì)胞干擾了BMSCs的成骨能力，可能與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病有關(guān)。以上實(shí)驗(yàn)提示骨質(zhì)疏松癥BMSCs向成骨細(xì)胞分化的能力降低，向脂肪細(xì)胞分化能力增強(qiáng)，導(dǎo)致成骨細(xì)胞數(shù)量和功能降低。干預(yù)BMSCs分化因素的研究是目前眾多學(xué)科研究的熱點(diǎn)，通過抑制BMSCs向脂肪細(xì)胞分化，達(dá)到預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的目的，也將成為防止廢用性骨質(zhì)疏松癥的一種新途徑。

影響脂肪細(xì)胞分化的各種因素最終都是通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的途徑誘導(dǎo)脂肪分化的，其中主要的轉(zhuǎn)錄因子PPARγ在脂肪細(xì)胞的分化過程中起到關(guān)鍵作用［8］。文獻(xiàn)［9］報(bào)道，PPARγ尤其是PPARγ2可介導(dǎo)脂質(zhì)累積和脂肪細(xì)胞特異性基因的表達(dá)。PPARγ2作為一種核受體，可調(diào)節(jié)BMSCs由骨細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而抑制骨形成，增強(qiáng)骨髓脂肪生成，這可能是活化的PPARγ2導(dǎo)致機(jī)體骨量減少的重要機(jī)制。Gustafson等［10］發(fā)現(xiàn)，PPARγ2激活有可能通過抑制Wnt/β-catenin通路促進(jìn)脂肪生成從而抑制了骨生成。目前，PPARγ2所介導(dǎo)的脂肪細(xì)胞特異性基因表達(dá)與廢用性骨質(zhì)疏松之間關(guān)系尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

骨碎補(bǔ)總黃酮是補(bǔ)腎壯骨中藥骨碎補(bǔ)的主要活性成分，是以柚皮苷為主的二氫黃酮類化合物，其制劑也是目前用來防治骨質(zhì)疏松的主要中成藥之一［11］。現(xiàn)代藥理研究［12］證實(shí)，骨碎補(bǔ)總黃酮具有增加骨量、改善骨質(zhì)量、維持骨微結(jié)構(gòu)的完整程度、增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性、促進(jìn)成骨細(xì)胞分化與增殖、促進(jìn)鈣在骨的沉積、增強(qiáng)骨的礦化及調(diào)節(jié)骨代謝過程中的細(xì)胞因子、抑制骨吸收等作用。國內(nèi)學(xué)者觀察骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)老年骨質(zhì)疏松癥患者骨痛和骨密度的影響，發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)總黃酮治療組骨密度均有明顯上升，且對(duì)骨痛的緩解效果明顯優(yōu)于對(duì)照組［13］。有學(xué)者通過離子導(dǎo)入骨碎補(bǔ)總黃酮治療骨質(zhì)疏松癥，發(fā)現(xiàn)該方法對(duì)于緩解骨質(zhì)疏松癥患者腰腿疼痛及提高腰椎骨密度有明顯的療效［14］。

本研究顯示，A組成脂油紅染色OD值均高于B、C、D組。說明各藥物干預(yù)組向脂肪細(xì)胞分化降和低，可以間接促使成骨細(xì)胞數(shù)量增多和成骨功能增強(qiáng)。本研究還發(fā)現(xiàn)，A組Wnt3a、LRP6、PPARγ2mRNA低于B、C、D組，Wnt3a、LRP6蛋白低于B、C、D組，PPARγ2蛋白低于C、D組; B組PDARγ2蛋白低于C、D組。說明骨碎補(bǔ)總黃酮含藥血清可以抑制廢用性骨質(zhì)疏松癥大鼠BMSCs成脂過程中PPARγ2mRNA的表達(dá)，從而起到抑制BMSCs成脂分化的作用。

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收稿日期:( 2015-04-10) ( 2015-04-25)

基金項(xiàng)目:江蘇省中醫(yī)藥局科技項(xiàng)目(BL13010);常州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(CJ20112014)。

文章編號(hào):1002-266X(2015)35-0028-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R714

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.35.009