小鼠來源的OX40融合蛋白的表達(dá)鑒定及優(yōu)化表達(dá)

杜雪梅，蘇毅，王曉燕，趙蕾，鞠吉雨，唐華平，馮永堂(青島市市立醫(yī)院，山東青島6607;濰坊醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室)

小鼠來源的OX40融合蛋白的表達(dá)鑒定及優(yōu)化表達(dá)

杜雪梅1，蘇毅1，王曉燕1，趙蕾1，鞠吉雨2，唐華平1，馮永堂2
(1青島市市立醫(yī)院，山東青島266071;2濰坊醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室)

摘要:目的鑒定及優(yōu)化表達(dá)小鼠來源的OX40融合蛋白。方法將已構(gòu)建好的pET32a-OX40重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂于含Amp平板篩選出陽性克隆，經(jīng)Western blotting鑒定融合蛋白，對(duì)陽性克隆株通過改變異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)濃度、培養(yǎng)溫度及時(shí)間條件，觀察目的融合蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒經(jīng)Western blotting鑒定，證實(shí)有目的蛋白表達(dá)。當(dāng)溫度、時(shí)間不變時(shí)，IPTG分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mmol/L，7個(gè)不同濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果以0.4mmol/L時(shí)蛋白表達(dá)量最高。當(dāng)IPTG濃度、時(shí)間不變時(shí)，在20、25、30、35、40℃不同的溫度點(diǎn)，以30℃時(shí)蛋白表達(dá)量最高。當(dāng)溫度、IPTG濃度不變時(shí)，1、2、3、4、5、6 h不同時(shí)間點(diǎn)，以4 h時(shí)蛋白表達(dá)量最高。結(jié)論小鼠來源的OX40融合蛋白在BL21細(xì)胞獲得成功表達(dá)，并獲得其最佳表達(dá)條件(IPTG濃度0.4mmol/L、溫度30℃、誘導(dǎo)4 h)。

關(guān)鍵詞:OX40融合蛋白; pET32a-OX40重組質(zhì)粒DNA;大腸桿菌BL21;動(dòng)物試驗(yàn)doi: 10.3969/j.issn.1002-266X.2015.35.008

機(jī)體的免疫應(yīng)答過程中，T細(xì)胞活化除了需要MHC-抗原肽外，還需要其他一些共刺激分子的協(xié)同參與，其中OX40/OX40L是一對(duì)近年來備受重視的新型共刺激分子［1］。OX40介導(dǎo)的共刺激信號(hào)在T細(xì)胞初次和再次免疫應(yīng)答中都發(fā)揮重要作用，可以促進(jìn)CD+4T細(xì)胞的活化、增殖、遷移，延長其壽命，并促進(jìn)生發(fā)中心的形成和細(xì)胞的分化成熟［2，3］。OX40主要表達(dá)在被抗原激活的特異性T細(xì)胞上，其生物學(xué)功能主要是強(qiáng)化和維持效應(yīng)特異性T細(xì)胞對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答，OX40表達(dá)和生物學(xué)功能的特殊性使其成為一個(gè)理想的免疫干預(yù)靶點(diǎn)［1］。如果對(duì)OX40及其配體間的相互作用進(jìn)行不同的干預(yù)措施，可能是提高或抑制免疫應(yīng)答能力及治療某些疾病的有效途徑之一。本研究將已構(gòu)建的小鼠來源的OX40原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，對(duì)其表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行鑒定，并對(duì)影響誘導(dǎo)表達(dá)的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)濃度、溫度及時(shí)間條件進(jìn)行了優(yōu)化探索，以便為該蛋白的批量表達(dá)、純化及下一步單克隆抗體的制備提供最佳條件。

1　材料與方法

1.1主要試劑IPTG(Gibco公司);中分子量蛋白Marker(上海生化所);甘氨酸、二硫蘇糖醇、考馬斯亮藍(lán)R-250、瓊脂糖(西班牙產(chǎn)品分裝)、Tween-20(Amresco分裝)、Tris(Amresco分裝)均購自上海生工生物工程公司;抗-His·tag單抗(Novagen公司);dAB顯色試劑盒(北京天為時(shí)代公司)。HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG(Jackson公司);丙烯酰胺、N，N-亞甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸(Bio-Rad公司)。

1.2質(zhì)粒及菌株DH5α由濰坊醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室凍存，重組質(zhì)粒pET32a-OX40(經(jīng)鑒定無誤)由濰坊醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室構(gòu)建并凍存。

1.3大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化用CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)，分裝成200 μL的小份，貯存于－70℃下備用。取200 μL感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上，加入pET32a-OX40重組質(zhì)粒DNA(含量不超過50 ng，體積不超過10 μL)，輕輕搖勻，冰上放置30min、42℃水浴中熱擊90 s后迅速置冰上冷卻3～5min，向管中加入1mL LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1 h，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)取100 μL涂布于含抗生素的篩選平板上，正面向上放置，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)16～24 h。

1.4小鼠來源的OX40融合蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定分別接種轉(zhuǎn)化有pET32a-OX40重組質(zhì)粒的單個(gè)菌落及相應(yīng)的空白質(zhì)粒對(duì)照單菌落pET32a(+)于5mL LB(Amp +)液體培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min，振

蕩培養(yǎng)過夜。次日以1∶100的比例轉(zhuǎn)種于新鮮的LB(Amp +)液體培養(yǎng)基中，于37℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.6后，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L(待定)，繼續(xù)培養(yǎng)3 h(待定)。離心收集菌體:取1.5mL菌液于已滅菌的1.5mL Eppendorf管中，12 000 r/min離心5min后取菌體沉淀，沉淀加上樣緩沖液水煮5min，與上清一同經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，然后進(jìn)行Western blotting鑒定。

1.5融合蛋白大量誘導(dǎo)IPTG濃度的優(yōu)化接種轉(zhuǎn)化有pET32a-OX40重組質(zhì)粒的單個(gè)菌落于5mL LB(Amp +)液體培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min，振蕩培養(yǎng)過夜。次日以1∶100的比例轉(zhuǎn)種于新鮮的LB(Amp +)液體培養(yǎng)基中，于37℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.6后，加入IPTG使終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mmol/L，37℃(待定)繼續(xù)培養(yǎng)3 h(待定)，離心收集菌體:取1mL菌液于已滅菌的1.5mL Eppendorf管中，12 000 r/min離心5min后取菌體沉淀，SDS-PAGE電泳分析，其余的離心沉淀－70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6融合蛋白大量誘導(dǎo)溫度條件的優(yōu)化同上搖菌至OD600約為0.6后，加入IPTG至終濃度為0.3mmol/L，分別于20、25、30、35、40℃振蕩培養(yǎng)3 h(待定)，同上收集菌體，SDS-PAGE電泳分析。

1.7融合蛋白大量誘導(dǎo)時(shí)間條件的優(yōu)化同上搖菌至OD600約為0.6后，加入0.3mmol/L IPTG，于28℃分別振蕩培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 h，同上收集菌體，SDS-PAGE電泳分析。

1.8不同條件誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的SDS-PAGE電泳上樣樣品處理取1.5mL細(xì)菌離心后的菌體沉淀以滅菌的PBS(pH7.4)洗滌3次，以100 μL PBS(pH7.4)重懸，超聲破菌。超聲條件:工作3 s、間歇3 s，連續(xù)99次，冰浴超聲，超聲結(jié)束，12 000 r/min離心30min，分別保留胞質(zhì)上清和包涵體沉淀。胞質(zhì)上清和培養(yǎng)基上清各加20 μL 1×SDS凝膠上樣緩沖液混勻，沉淀加40 μL 1×SDS凝膠上樣緩沖液混勻，和蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)一起于沸水浴中煮沸5min，12 000 r/min離心5min，取上清20 μL上樣。

2　結(jié)果

2.1 pET32a-OX40重組質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化及融合蛋白的表達(dá)和鑒定pET32a-OX40重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21后，在IPTG濃度為0.5mmol/L、溫度37℃、誘導(dǎo)3 h條件下可獲得OX40融合蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)后pET32a、誘導(dǎo)前pET32a、誘導(dǎo)后全菌體、胞質(zhì)上清、誘導(dǎo)后包涵體、培養(yǎng)基上清分別經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示:重組載體經(jīng)誘導(dǎo)后在蛋白Marker的42.7～66.2 kD出現(xiàn)新的融合蛋白條帶，融合蛋白主要存在于細(xì)胞內(nèi)，未能分泌到細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)的融合蛋白主要存在于包涵體中，細(xì)胞質(zhì)中未見到明顯可溶性目的蛋白(圖1)。包涵體經(jīng)Western blotting鑒定，可以看到一明顯的條帶，表明融合蛋白可與抗-His·tag的一抗發(fā)生特異性結(jié)合，說明我們獲得OX40胞外段融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明融合蛋白主要存在于細(xì)胞內(nèi)的包涵體中。

圖1　pET圖32a-OX圖40誘導(dǎo)表達(dá)及融合蛋白分布情況的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果

2.2 IPTG濃度對(duì)小鼠OX40融合蛋白表達(dá)的影響

當(dāng)溫度、時(shí)間不變時(shí)，IPTG分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mmol/L，7個(gè)不同濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果以0.4mmol/L時(shí)蛋白表達(dá)量最高(圖2)。

圖2　不同IPTG濃度誘導(dǎo)的分析結(jié)果

2.3溫度條件對(duì)小鼠OX40融合蛋白表達(dá)的影響當(dāng)IPTG濃度、時(shí)間不變時(shí)，在20、25、30、35、40℃不同的溫度點(diǎn)，以30℃時(shí)蛋白表達(dá)量最高(圖3)。

2.4培養(yǎng)時(shí)間對(duì)小鼠OX40融合蛋白表達(dá)的影響當(dāng)溫度、IPTG濃度不變時(shí)，在1、2、3、4、5、6 h不同時(shí)間點(diǎn)，以4 h時(shí)融合蛋白的表達(dá)量最高(圖4)。

圖3　不同溫度誘導(dǎo)的分析結(jié)果

圖4　不同時(shí)間誘導(dǎo)的分析結(jié)果

3　討論

在機(jī)體的免疫應(yīng)答過程中，OX40/OX40L作為一對(duì)重要的共刺激分子，為T、B細(xì)胞的激活提供了重要的共刺激信號(hào)［4，5］。由于OX40/OX40L在機(jī)體的免疫應(yīng)答和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并隨著生物學(xué)功能的進(jìn)一步揭示逐漸成為臨床干預(yù)自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)和腫瘤的一個(gè)理想靶點(diǎn)［6～10］;通過對(duì)其干預(yù)所進(jìn)行的免疫治療在自身免疫病動(dòng)物模型上已經(jīng)取得可喜的效果［1，7，11］。

本試驗(yàn)利用該室自己構(gòu)建的帶有His·tag標(biāo)簽的pET32a-OX40重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，經(jīng)Western blotting檢測融合蛋白可與抗-His·tag的一抗發(fā)生特異性的結(jié)合，說明獲得了OX40融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物。當(dāng)然，對(duì)于融合標(biāo)簽的檢測只是一個(gè)利于純化的相對(duì)特異性標(biāo)記，后續(xù)我們將以抗-OX40的抗體或OX40L對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的特異性作進(jìn)一步確認(rèn)。由電泳圖可見，融合蛋白主要存在于菌體超聲破碎后的沉淀物即包涵體中，包涵體是變性的不溶性顆粒，其主要成分為表達(dá)產(chǎn)物，其次還有菌體膜蛋白、脂質(zhì)、多糖核酸物質(zhì)以及RNA聚合酶等雜質(zhì)。以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白生產(chǎn)具有以下優(yōu)勢［12］:①包涵體具有高密度且在水溶液通常不溶解，有利于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。②重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)，有效抵御了宿主菌蛋白酶對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的降解。③對(duì)于生產(chǎn)那些處于天然構(gòu)象時(shí)對(duì)宿主細(xì)胞有毒害的蛋白時(shí)，包涵體的形成無疑是最佳選擇。外源基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)與培養(yǎng)條件密切相關(guān)，環(huán)境條件不僅對(duì)菌體的生長和代謝有影響，還會(huì)影響到宿主、表達(dá)載體和外源基因三者之間的關(guān)系，從而影響外源基因的高效表達(dá)。

為提高OX40融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量和包涵體的純度，我們對(duì)培養(yǎng)時(shí)間、溫度、IPTG濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，以求獲得最大量的蛋白表達(dá)。一般認(rèn)為高溫(42℃)會(huì)促進(jìn)包涵體的形成，但我們反復(fù)摸索的實(shí)驗(yàn)條件發(fā)現(xiàn)，30℃時(shí)OX40融合蛋白的表達(dá)量較高;加入不同濃度的IPTG，目的蛋白的表達(dá)量差別不是特別明顯，當(dāng)IPTG濃度為0.4mmol/L時(shí)表達(dá)量稍高;在誘導(dǎo)培養(yǎng)的不同時(shí)間取樣觀察發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長，目的蛋白的表達(dá)量明顯增加，4 h時(shí)達(dá)最高值，繼續(xù)誘導(dǎo)，目的蛋白表達(dá)量反而降低。因此，我們選擇的誘導(dǎo)參數(shù)是溫度30℃、IPTG濃度0.4mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間4 h，在此條件下OX40融合蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的20%左右，獲得了較理想的表達(dá)條件。

總之，小鼠來源的OX40融合蛋白的鑒定及高效表達(dá)條件的優(yōu)化不僅為進(jìn)一步批量獲取和純化目的蛋白提供了技術(shù)參數(shù)，而且也為制備OX40單克隆抗體以及進(jìn)行相關(guān)的橫向研究打下了良好的基礎(chǔ)，這在未來的基礎(chǔ)和臨床研究中將有極好的開發(fā)應(yīng)用前景。

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通信作者:唐華平，馮永堂

文章編號(hào):1002-266X(2015)35-0025-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R378.2