過氧化物酶增殖體激活受體γ輔助激活子-1α在膿毒癥肺損傷大鼠肺組織中的表達

焦　艷　雷傳江　王關嵩

戢福云　徐　靜　王建春

過氧化物酶增殖體激活受體γ輔助激活子-1α在膿毒癥肺損傷大鼠肺組織中的表達

焦艷雷傳江王關嵩

戢福云徐靜王建春

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是臨床常見的危重病癥[1-2]。目前認為ALI/ARDS的實質是一種炎癥反應，其發病與炎癥失控引起的過度炎癥反應密切相關，主要的病理改變表現為彌漫性肺泡損傷、肺毛細血管通透性增加、肺泡及間質水腫以及大量炎癥細胞浸潤引起的肺部炎癥[3-4]。既往研究表明過氧化物酶增殖體激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)可通過下調NF-κB表達及其活性從而抑制致炎因子的釋放，參與ALI炎癥調控且具有抗炎作用，最終對ALI肺組織產生保護作用[5-7]。過氧化物酶增殖體激活受體γ輔助激活子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator -1α, PGC-1α)是一種核受體家族轉錄輔助激活因子，可與PPARγ等多種核受體轉錄因子相互作用，增強靶基因轉錄效率，廣泛參與調節組織細胞的氧化應激、能量代謝等[8]。而在急性肺損傷的發生發展中，PGC-1α的表達及其作用尚未見報道。為研究在ALI中，PGC-1α是否可通過上調PPARγ表達及其活性從而對肺損傷產生保護作用，本實驗采用盲腸結扎穿孔復制的大鼠ALI模型，觀察PGC-1α的表達，并探討其在ALI發病中的作用。

材料與方法

一、試劑及儀器

大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白介素-6(interleukin-6, IL-6) ELISA檢測試劑盒(上海滬尚科技有限公司)，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(Pierce, Rockford, USA)，PGC-1α鼠多克隆抗體(abcam，ab54481)，GAPDH鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗(羊抗兔IgG， Sigma)，ECL發光顯色劑(Thermo)，Trizol(Invitrogen, USA)，逆轉錄試劑盒(TaKaRa，Cat.#RR037A)，SYBR定量PCR檢測試劑盒(TaKaRa，Cat.#RR820A)；垂直電泳儀、濕轉電轉儀(Bio-Rad公司，美國)，酶標分析儀(Molecular Devices，美國)，凝膠成像分析系統(Alpha Innotech，美國)。

二、實驗動物

54只清潔級雄性SD大鼠(180～220 g，購于第三軍醫大學實驗動物中心)隨機分為9組(正常對照組；假手術術后3、6、12、24 h組和手術術后3、6、12、24 h組)，每組6只。正常對照組(control group)：不做任何處理；假手術組(sham group)：行開腹手術，不經盲腸結扎穿孔手術(cecum ligation perforation, CLP)；手術組(the CLP group)：行開腹盲腸結扎穿孔手術；假手術及手術組按照設計的時間點分別于手術后3、6、12、24 h處死大鼠。

三、實驗方法

1.盲腸結扎穿孔復制膿毒癥肺損傷大鼠模型：大鼠經1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，采用腹正中切口無菌打開腹腔，將盲腸移出腹腔，用4-0絲線在盲腸中部進行結扎，以12號注射針頭在盲腸結扎處至尖端間來回穿刺2次，將結扎穿孔盲腸送回腹腔，并擠壓適量腸內容物至腹腔，縫合腹部切口，將動物放置籠內自由活動，不禁飲食。假手術組不結扎、不刺破，其余處理同手術組。

2.肺組織病理學檢查：取大鼠右肺下葉組織經10%中性甲醛固定后，分別進行脫水、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織損傷情況。

3.ELISA檢測血漿TNF-α、IL-1β、IL-6水平：按照ELISA試劑盒說明書檢測各標本血漿TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達水平。每樣本和標準品均設雙復孔，獲取酶標儀450 nm處光密度(optical density, OD)值，并根據相應標準品OD值繪制標準曲線，計算各孔樣本中TNF-α、IL-1β、IL-6含量，取平均值為統計數據。

4.Real-time PCR檢測PGC-1αmRNA表達：按說明書使用Trizol法提取大鼠肺組織總RNA，微量核酸蛋白檢測儀測定樣品RNA的純度和濃度， A260 nm/A280 nm在1.8～ 2.0為合格樣本。將 mRNA反轉錄為cDNA，熒光定量PCR檢測各指標表達，反應條件：95℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s總共40個循環。以GAPDH為內參采用2-△△Ct法相對定量，每組設3個復孔，重復3次，計算平均值。引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司設計合成。引物序列： PGC-1α： FP: GCCACTACAGACACCGCA

C，RP:CCTTTCAGACTCCCGCTTC;GAPDH:FP:ACA

GCAACAGGGTGGTGGAC，RP: TTTGAGGGTGCAGC

AACTT。

5.Western blot檢測PGC-1α蛋白表達: 按RIPA說明書步驟提取肺組織總蛋白，濃度由微量核酸蛋白檢測儀測定。將所提取的蛋白樣本(每個標本100 ug)進行10% SDS-PAGE電泳2 h(恒壓80V)，再進行濕轉轉至PVDF膜上(恒流300 mA，90 min)，TBST洗膜后5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入一抗PGC-1α鼠多克隆抗體(1︰1000)和GAPDH鼠單克隆抗體(1︰3000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后加入HRP標記的二抗(羊抗兔IgG，1︰5000)37 ℃孵育1 h，TBST洗膜后加入ECL發光顯色劑在凝膠成像系統中掃描成像行條帶分析。用Quantity One軟件測定各條帶積分光密度值，以GAPDH的條帶為內參，以PGC-1α與GAPDH片段的條帶光密度比值作為各組PGC-1α的相對量進行比較。

四、統計學方法

結果

一、HE染色觀察小鼠肺組織病理變化

分別摘取control、sham及CLP組各時間點大鼠右肺下葉經HE染色后，普通光學顯微鏡下觀察。可見control、sham組大鼠肺組織細胞結構清楚，肺泡壁薄，邊緣完整，肺泡腔內無液體及炎癥細胞，肺間質無炎癥滲出。CLP 3、6、12、24 h組大鼠肺組織充血，肺泡塌陷，肺泡間隔增厚，部分肺泡腔內可見液體滲出，肺間質水腫，大量炎癥細胞浸潤，見圖1。

注：正常: control；A：sham 3 h；B：sham 6 h；C：sham 12 h；D：sham 24 h；E：CLP3 h；F：CLP6 h；G：CLP12 h；H：CLP24 h；X200

二、ELISA 檢測血漿TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平

將收集的血漿按照ELISA試劑盒說明書步驟進行TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測。結果提示：control組和sham組各時間點大鼠血漿各炎癥因子表達水平無統計學差異，CLP組大鼠血漿各炎癥因子水平較正常和假手術組明顯升高(P<0.05)，并隨著手術時間的進展逐漸升高(P<0.05)，見圖2。

三、Real-time PCR檢測大鼠肺組織PGC-1α mRNA表達

為探討PGC-1α mRNA在盲腸結扎穿孔復制的大鼠急性肺損傷模型中的表達變化，分別提取control、sham及CLP組各時間點大鼠肺組織總RNA，經逆轉錄成cDNA后行real-time PCR檢測。相比于control與sham組，大鼠經CLP后肺組織PGC-1αmRNA表達明顯下調(P<0.05)，并隨著術后時間的延長逐漸降低至實驗結束(P<0.05)，見圖3。

注：正常: control；1：sham 3 h；2：sham 6 h；3：sham 12 h；

四、Western Blot檢測大鼠肺組織PGC-1α蛋白表達

為探討PGC-1α蛋白在盲腸結扎穿孔復制的大鼠急性肺損傷模型中的表達變化，分別提取control、sham及CLP組各時間點大鼠肺組織總蛋白，行Western Blot檢測。相比于control與sham組，大鼠經CLP后肺組織PGC-1α蛋白表達明顯下調(P<0.05)，見圖4。

注：正常:control；1：sham 3 h；2：sham 6 h；3：sham 12 h；

討論

膿毒癥是由多種感染引起的以全身炎癥反應為特征的臨床綜合征，若未對膿毒癥進行有效控制，則可能發展至多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)[9]。重度膿毒癥的發病率接近132/100 000，病死率約為20%～50%[10]。而在多器官功能衰竭的發展中，急性肺損傷導致的呼吸功能紊亂常常最早發生[11]。眾所周知，盲腸結扎穿孔手術引起的多重細菌感染可致膿毒癥，其主要表現為肺組織炎癥細胞浸潤和炎癥因子生成增加，最終導致肺組織損傷，因此本研究使用這一模型進行膿毒癥肺損傷的研究[12]。在本研究的模型中觀察到大鼠經CLP后3 h，肺組織開始出現水腫、出血、肺泡損傷、炎癥細胞浸潤和肺不張，并隨著術后時間的延長肺損傷情況逐漸加重。同時，血漿炎癥因子在CLP后迅速升高，并隨著術后時間的延長逐漸上升，并持續高水平表達至實驗結束，提示大量炎癥因子釋放參與ALI。而control組和sham組各時間點間大鼠的肺組織病理變化、血漿炎癥因子的表達均無顯著性統計學差異。

注：正常: control；1：sham 3 h；2：sham 6 h；3：sham 12 h；4：sham 24 h；5：CLP 3 h；6：CLP 6 h；7：CLP 12 h；8：CLP 24 h；

PGC-1α作為一種核輔助激活因子，主要表達于心臟、腎臟、骨骼肌、棕色脂肪組織等高能量代謝組織，參與線粒體生物合成、適應性產熱、肝糖異生、肌肉類型轉換、脂肪酸氧化等生理過程。Kim等[13]發現小鼠經腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可引起全身性炎癥反應，在注射后16 h小鼠心、肝、腎組織中PGC-1α mRNA的表達顯著降低。Handschin等[14]發現特異性敲除小鼠PGC-1α后，小鼠骨骼肌及血漿中炎癥因子IL-6水平升高。另有研究發現，使用LPS刺激成年大鼠心肌細胞，可經Toll-樣受體抑制PGC-1α的表達，繼而導致心肌細胞能量代謝障礙甚至凋亡[15]。以上研究表明在LPS刺激引起全身炎癥反應后，多器官組織中PGC-1α的表達發生變化，且PGC-1α表達的下調伴隨著炎癥因子表達的上調，提示PGC-1α可參與炎癥反應的調節。

在本實驗中，我們觀察到正常大鼠肺組織表達較高水平的PGC-1α。在CLP引起的膿毒癥肺損傷時，肺組織PGC-1αmRNA和蛋白表達水平均逐漸降低并持續至實驗結束。而sham組各時間點大鼠肺組織PGC-1αmRNA和蛋白表達水平與control組無統計學差異，說明CLP組大鼠肺組織PGC-1α表達水平的降低與手術應激反應無關。與此同時，CLP組大鼠血漿炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6大量釋放，提示PGC-1α表達的降低可能與機體炎癥失控相關。以上結果顯示膿毒癥所致的肺損傷可下調肺組織PGC-1αmRNA和蛋白的表達，提示PGC-1α可能參與了ALI的發生發展過程。并且既往研究表明在ALI時，PPARγ可通過負調控NF-κB減輕肺部炎癥，從而對肺組織產生保護作用[5-7]。而PPARγ的激活需要與PGC-1α等輔助激活子結合，在許多氧化應激及代謝性疾病研究過程中發現PGC-1α可上調PPARγ的表達，且可通過PPARγ發揮其生物功能[16-17]。而在急性肺損傷中，PGC-1α可能亦具有通過上調PPARγ表達及其活性從而對肺損傷產生保護的作用。

本研究結果表明，正常大鼠肺組織可表達較高水平的PGC-1α，而膿毒癥所致的肺損傷可下調肺組織PGC-1αmRNA和蛋白的表達。與此同時，血漿炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6大量釋放，提示PGC-1α表達的下調可能與機體炎癥失控有關，從而參與ALI的發生發展過程，但其具體作用及機制還需進一步探索。結合既往研究發現，我們推測PGC-1α可能可通過上調PPARγ表達及其活性從而對肺損傷產生保護作用，這一假設還需進一步驗證。

參考文獻

1金發光. 急性肺損傷的診治研究現狀及進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版, 2013, 6(1): 1-3.

2施卉, 任成山. 急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征基礎及臨床研究進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版, 2013, 6(4): 350-355.

3ARDS Definition Task Force, Ranieri VM, Rubenfeld GD, et al. Acute respiratory distress syndrome: the Berlin definition[J]. JAMA, 2012, 307(23): 2526-2533.

4Matthay MA, Idell S. Update on Acute Lung Injury and Critical Care Medicine 2009[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2010, 181(10): 1027-1032.

5Liu D, Zeng BX, Zhang SH, et al. Rosiglitazone, a peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonist, reduces acute lung injury in endotoxemic rats[J]. Crit Care Med, 33(10): 2309-2316.

6Chima RS, Hake PW, Piraino G, et al. Ciglitazone ameliorates lung in ammation by modulating the inhibitor kappaB protein kinase/nuclear factor-kappa B pathway after hemorrhagic shock[J]. Crit Care Med, 2008, 36(10): 2849-2857.

7Xiao B, Xu J, Wang G, et al. Troglitazone-activated PPARc inhibits

LPS-induced lung alveolar type Ⅱ epithelial cells injuries via TNF-a[J]. Mol Biol Rep, 2011, 38(8): 5009-5015.

8Puigserver P, Wu Z, Park CW, et al. A cold-inducible coactivetor of nuclear receptors linked to adaptive thermogenesis[J]. Cell, 1998, 92(6): 829-839.

9Oberholzer C, Oberholzer A, Clare-Salzler M, et al. Apoptosis in sepsis: a new target for therapeutic exploration[J]. FASEB J, 2001, 15(6): 879-892.

10Martin GS, Mannino DM, Eaton S, et al. The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000[J]. N Engl J Med, 2003, 348(16): 1546-1554.

11Takano K, Yamamoto S, Tomita K, et al. Successful treatment of acute lung injury with pitavastatin in septic mice: potential role of glucocorticoid receptor expression in alveolar macrophages[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2011, 336(2): 381-390.

12Wichterman KA, Baue AE, Chaudry IH. Sepsis and septic shock: a review of laboratory models and a proposal[J]. J Surg Res, 1980, 29(2): 189-201.

13Kim MS, Shigenaga JK, Moser AH, et al. Suppression of estrogen-related receptor alpha and medium-chain acyl-coenzyme A dehydrogenase in the acutephase response[J]. J Lipid Res, 2005, 46(10): 2282-2288 .

14Handschin C, Choi CS, Chin S, et al. Abnormal glucose homeostasis

in skeletal muscle-specific PGC-1alpha knockout mice reveals skeletal muscle-pancreatic beta cell crosstalk[J]. J Clin Invest, 2007, 117(11): 3463-3474.

15Schilling J, Lai L, Sambandam N, et al. Toll-like receptor-mediated

inflammatory signaling reprograms cardiac energy metabolism by repressing peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1 (PGC-1) signaling[J]. Circ Heart Fail, 2011, 4(4): 474-482.

16Zhang Y, Ba Y, Liu C, et al. PGC-1alpha induces apoptosis in human epithelial ovarian cancer cells through a PPARgamma-dependent pathway[J]. Cell Res, 2007, 17(4): 363-373.

17Jie L, Dai A, Hu R, et al. Positive correlation between PPARg/PGC-1a and g-GCS in lungs of rats and patients with chronic obstructive pulmonary disease[J]. Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai), 2010, 42(9): 603-614.

(本文編輯：黃紅稷)

焦艷，雷傳江，王關嵩，等. 過氧化物酶增殖體激活受體γ輔助激活子-1α在膿毒癥肺損傷大鼠肺組織中的表達[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(2)： 154-159.

·論著·

【摘要】目的探討膿毒癥肺損傷大鼠過氧化物酶增殖體激活受體γ輔助激活子-1α(PGC-1α)在急性肺損傷(ALI)發病中的作用。方法將54只SD大鼠隨機分為9組：正常對照組(6只)；假手術組3、6、12、24 h(各6只)；盲腸結扎穿孔組3、6、12、24 h(各6只)。利用盲腸結扎穿孔手術復制大鼠急性肺損傷模型。HE染色觀察大鼠肺組織病理情況；ELISA檢測血漿炎癥因子(IL-1β、TNFα、IL-6)表達變化；real-time PCR檢測肺組織PGC-1α mRNA表達；Western blot檢測肺組織PGC-1α蛋白表達情況。結果大鼠經盲腸結扎穿孔后，肺組織顯示出血、肺泡塌陷、肺泡間隔增厚、肺間質水腫及大量炎癥細胞浸潤等肺部炎癥的表現。與正常對照組比較，假手術組各時間點大鼠血漿炎癥因子(IL-1β、TNFα、IL-6)、肺組織PGC-1αmRNA及蛋白表達水平均無統計學差異(P>0.05)；盲腸結扎穿孔組各時間點血漿炎癥因子(IL-1β、TNFα、IL-6)表達水平較正常對照組明顯升高(P<0.05)，且成時間效應關系；肺組織PGC-1α mRNA及蛋白表達水平較正常對照組明顯降低(P<0.05)，并隨著術后時間的延長逐漸降低(P<0.05)。結論正常大鼠肺組織可表達PGC-1α，膿毒癥肺損傷大鼠肺組織內PGC-1α的mRNA和蛋白表達水平下降，提示PGC-1α可能參與ALI的發生發展過程。

【關鍵詞】膿毒癥；急性肺損傷；輔助激活子-1α，增殖體激活受體γ，過氧化物酶

Expressions of peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator -1α in lung tissues of rats with acute lung injury by sepsisJiaoYan,LeiChuanjiang,WangGuansong,JiFuyun,XuJing,WangJianchun.DepartmentofRespiratoryDisease,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China

Correspondingauthor：WangJianchun,Email:wjc5577@126.com

【Abstract】ObjectiveTo observe the changes of peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator- 1α(PGC-1α) expression in lung tissues of rats with acute lung injury ( ALI ) and discuss its role in the pathogenesis of ALI. MethodsA total of 54 SD rats were randomly divided into 9 groups: the control group (6); the sham group 3 h, 6 h, 12 h, 24 h (6 for each); the cecum ligation perforation (CLP) group 3 h, 6 h, 12 h, 24 h (6 for each). The rat ALI model was induced by cecum ligation perforation. Histological changes of the lungs were observed after HE staining; It was detected that serum inflammatory cytokines (IL-1 beta, TNF alpha, IL-6) expressions by ELISA; Lung tissues PGC-1α mRNA expressions was dected by real-time PCR ; The PGC-1α protein in lung tissues was dected by Western blot. ResultsCompared with the control and sham group, the lung tissues of the CLP group rats were damaged histopathologically, such as hemorrhage, alveolar collapse, thickening of alveolar interval, pulmonary interstitial edema, and a large number of inflammatory cells infiltration; Compared with the control group, the plasma inflammatory factors (IL-1β, TNFα, IL-6)and the expressions of PGC-1α mRNA and protein in lung tissues of the sham group rats had no statistical difference(P>0.05). Compared with the control and sham group, the plasma inflammatory factors(IL-1β, TNFα, IL-6)of the CLP group rats were significantly increased and as time effect relationship(P<0.05); the expressions of PGC-1α mRNA and protein in lung tissues were significantly decreased and longer duration of postoperative gradually reduced(P<0.05). ConclusionLung tissues of normal rats express PGC-1α. The PGC-1α mRNA and protein in the rats of ALI by sepsis were decreased, which infers that PGC-1α may be associated with inflammation and damage of lung tissue.

【Key words】Sepsis;Acute lung injury;Peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1 alpha

收稿日期：(2014-12-03)

文獻標識碼：中圖法分類號： R563 A

通訊作者：王建春，Email: wjc5577@126.com

基金項目：作者單位： 400037 重慶，第三軍醫大學新橋醫院呼吸內科

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.02.004