人肺腺癌厄洛替尼耐藥細胞PC9/ER的建立及奧曲肽改善耐藥機制研究

江飛龍　韓　靜　朱海振　陳光朋　孫建國　陳正堂

人肺腺癌厄洛替尼耐藥細胞PC9/ER的建立及奧曲肽改善耐藥機制研究

江飛龍韓靜朱海振陳光朋孫建國陳正堂

目前，肺癌仍是全球死亡人數最高的惡性腫瘤，約占所有惡性腫瘤28%[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌的主要病理類型，約占70%[2]。不少患者確診時已為晚期，喪失了手術機會，生存期短，病死率高。近年來，分子靶向治療給表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)突變型的肺癌患者帶來了希望，尤以酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)如厄洛替尼為代表，但患者最終都會產生耐藥并出現腫瘤復發。因此，厄洛替尼獲得性耐藥機制已成為研究熱點。胰島素樣生長因子-1受體(insulin like growth factor 1 receptor, IGF-1R)被認為可通過旁路激活的方式激活下游的PI3K/Akt通路，是厄洛替尼獲得性耐藥的機制之一[3]。奧曲肽(octreotide, OCT)是一種人工合成的多肽，有調控IGF-1的轉錄并抑制IGF-1分泌的作用[4-5]。本課題組前期證實了PC9/ER細胞較親本細胞IGF-1R表達增高，設想OCT可通過抑制IGF-1，進而抑制IGF1-R、PI3K-Akt信號通路而改善PC9/ER的耐藥性。本實驗旨在探討OCT改善厄洛替尼耐藥的可能機制。

材料與方法

一、實驗材料

1.細胞株：人肺腺癌細胞株PC9購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，PC9/ER由韓靜博士構建贈送。

2.藥品與試劑：鹽酸厄洛替尼購自上海安格化工有限公司，RPMI 1640培養液和胎牛血清購自美國Gibco公司，奧曲肽(OCT)購自瑞士諾華制藥有限公司，胰蛋白酶購自碧云天公司，抗體IGF-1R、p-IGF-1R、Akt、p-Akt購自美國Cell Signaling Technology公司，抗體β-actin購自碧云天公司。CCK-8購自東仁化學有限公司，SYBR熒光定量PCR試劑盒、RNA 提取試劑盒，兩步法逆轉錄試劑盒均購自Takara公司，IGF-1、IGF-1R、β-actin引物均由上海英駿生物技術有限公司合成。ELISA試劑盒購自美國Cloud-Clone公司。

二、實驗方法

1.細胞培養：肺腺癌細胞PC9，PC9/ER用含有10% 胎牛血清，1%雙抗的RPMI 1640完全培養基，置于37 ℃恒溫、5% CO2培養箱中培養。PC9/ER用濃度為0.01 μmol/L厄洛替尼完全培養基維持培養。

2.CCK-8法檢測細胞抑制率和改善耐藥倍數：將對數生長期的PC9、PC9/ER 細胞用胰酶消化，用完全培養基配制成濃度為4.5×104個/ml單細胞懸液，每孔100 μl接種于96孔板，置37 ℃，5% CO2培養箱中。細胞貼壁后，換用無血清培養基培養24 h，使細胞周期同步化，用完全培養基配置厄洛替尼溶液使終濃度分別為(0.001 μmol/L、0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1.0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)，及聯合OCT的濃度為(10 μmol/L)，并設置空白組、對照組，每個濃度設置3個復孔。培養48 h，每孔加CCK-8 10μl，置培養箱中培養1 h，用酶標儀測量波長450 nm處的OD值，使用GraphPad Prism 6軟件計算IC50。耐藥倍數=IC50(PC9/ER細胞)/IC50(PC9細胞)。

3.Western bolt檢測蛋白表達:取處于對數生長期的PC9、PC9/ER細胞提取總蛋白。PC9/ER細胞分別加入厄洛替尼單藥(1.0 μmol/L)、OCT單藥(10 μmol/L)及聯合兩藥處理48 h收集各組細胞，提取細胞總蛋白。細胞總蛋白經5%SDS-PAGE濃縮膠10% SDS-PAGE分離膠電泳，轉移至PVDF膜。封閉液室溫封閉1 h，加入相應抗體Akt(1︰1000)IGF-1R、p-Akt(1︰500)，p-IGF-1R(1︰300)，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次后加入相應辣根過氧化物酶標記的二抗(1︰5000)，室溫搖床孵育1 h，TBST漂洗3次。用化學發光試劑顯影，凝膠成像分析儀抓圖，保存圖片。實驗重復3次。

4.實時熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR, qRT-PCR)法檢測IGF-1、IGF-1R mRNA表達量：RNA提取試劑盒分別提取總RNA(OCT處理組，對照組)，兩步法逆轉錄試劑盒，逆轉錄RNA(1000 μg)為cDNA。Real-time PCR法對基因表達進行相對定量分析。PCR擴增在ABI7500熒光定量PCR儀上運行。PCR反應體系為:預變性：95 ℃ 30 s；PCR反應：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40循環；融解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反應完成后，應用ABI7500軟件中的Comparative Delta-delta Ct(ΔΔCT)方法，以β-actin為內參照對IGF-1、IGF-1R的表達行相對定量分析。實驗重復3次。引物序列，見表1。

表1　相關引物設計

注：IGF-1: 胰島素樣生長因子-1；IGF-1R：胰島素樣生長因子-1受體；β-actin： β-肌動蛋白

5.ELISA法測PC9/ER細胞上清中IGF-1的含量：將對數生長期的PC9、PC9/ER細胞用胰酶消化，用完全培養基配制成濃度為4×104個/ml單細胞懸液，每孔500 μl接種于24孔板，置37 ℃，5% CO2培養箱。細胞貼壁后，換用無血清培養基配置OCT溶液使濃度為(1.0 μmol/L、10 μmol/L)，每個濃度設置3個復孔，分別于12 h、24 h、48 h時間取上清離心(1000×g，20 min)。檢測板每孔加樣100 μl，37 ℃孵育2 h，棄樣品，加檢測溶液A 100 μl，37 ℃孵育1 h，洗板3次，加檢測溶液B 100 μl，37 ℃孵育30 min，洗板5次，加TMB底物90 μl，37 ℃孵育20 min，加終止液50 μl，立即450 nm讀數。

三、統計學方法

應用SPSS 13.0統計學軟件對結果數據進行統計學處理。兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

一、PC9/ER耐藥性檢測

通過低濃度厄洛替尼培養的方法，歷時6個月后成功建立耐厄洛替尼PC9細胞，命名為PC9/ER。0.01 μmol/L濃度維持其耐藥性。在相同厄洛替尼濃度下，PC9的抑制率高于PC9/ER。厄洛替尼對兩細胞的IC50為4.809 μmol/L(PC9/ER)和0.4608 μmol/L(PC9)，耐藥指數為10.43，見圖1。

二、Western bolt檢測PC9及PC9/ER IGF-1R、p-IGF-1R、Akt、p-Akt的表達

與親本PC9細胞對比，PC9/ER中IGF-1R、p-IGF-1R、Akt、p-Akt均升高，見圖2。

圖1　PC9ER細胞耐藥性的檢測

圖2　Western bolt檢測PC9及PC9/ER細胞中IGF-1R、

三、OCT體外改善耐藥性實驗

聯合應用低劑量OCT(10 μmol/L)可明顯降低厄洛替尼對PC9/ER的半數抑制濃度，以細胞抑制率為縱坐標，厄洛替尼濃度為橫坐標作圖，在相同厄洛替尼濃度下聯用OCT抑制率更高，見圖3。單用厄洛替尼和聯用OCT的IC50分別為4.809 μmol/L和0.4998 μmol/L，改善倍數為9.62倍。

圖3　OCT改善PC9/ER耐藥實驗

四、OCT改善耐藥機制的探討

Western bolt結果提示：OCT和厄洛替尼聯合處理PC9/ER細胞后發現IGF-1R、p-IGF-1R、Akt、p-Akt蛋白降低，見圖4。ELISA結果提示：以時間為橫坐標，IGF-1含量為縱坐標作圖，OCT能抑制IGF-1，且呈時間、濃度依賴性，見圖5。qRT-PCR結果提示：OCT能降低IGF-1，IGF-1R mRNA表達量，見圖6。

注：E為厄洛替尼，OCT為奧曲肽

圖5　ELISA檢測不同濃度OCT處理后細胞上清液中

注：*P<0.05 vs. control

討論

對晚期NSCLC患者，EGFR-TKIs較傳統放化療等治療手段能選擇性地殺傷腫瘤細胞，且副作用小，療效更佳。初治有效的腫瘤患者最終因獲得性耐藥出現復發或者轉移[6]，其中位有效時間約為6～10個月[7]。獲得性耐藥機制與眾多因素有關，其中EGFR T790M突變占50%以上，此外還有c-Met的擴增，上皮間質轉化和IGF1-R的旁路激活等[8]。近期越來越多的研究表明跨膜蛋白IGF1-R通過旁路途徑激活EGFR下游的PI3K/Akt信號通路，使細胞達到持續增殖與抗凋亡的效果，導致患者對EGFR-TKI治療無效[3, 9]，產生耐藥。所以甄別患者獲得性耐藥的類型，針對性的治療顯得尤為重要。本研究采用的人NSCLC細胞株PC9具有EGFR外顯子19E746～A750缺失突變，對厄洛替尼高度敏感。通過低濃度厄洛替尼持續誘導6個月，成功誘導出人肺腺癌耐厄洛替尼細胞PC9/ER，通過CCK-8實驗證實耐藥細胞的耐藥指數為10.43。Western bolt檢測發現IGF-1R，p-IGF-1R在耐藥細胞中比非耐藥細胞表達增高。說明PC9獲得性耐藥與IGF-1R通路激活有關。

OCT是人工合成的生長抑素類似物，具有天然生長抑素的類似作用，較天然的生長抑素有半衰期長、作用更強、更特異的特點。OCT可通過多種機制發揮抗腫瘤作用，如生長抑素與生長抑素受體結合后，能抑制腫瘤增殖，促進凋亡，阻滯細胞周期進程。現有研究表明OCT可通過上述機制發揮對NSCLC、胃癌、神經內分泌腫瘤的抑制作用[4,10-12]。生長抑素還能調控IGF-1的轉錄并抑制IGF-1分泌。Akt是PI3K/Akt通路的核心蛋白，C端的調節結構域Ser473的磷酸化是Akt的功能活化狀態，在調節EGFR-TKI耐藥中起到非常重要的作用，抑制Akt信號通路可使腫瘤細胞對治療藥物的敏感性增加[13]。本研究通過CCK-8法檢測了厄洛替尼聯用OCT的改善耐藥倍數為9.62。聯合用藥較單用藥更能有效的殺傷細胞，聯合用藥后IGF-1R，p-IGF-1R表達降低，對PI3K/Akt信號通路抑制作用更強，而OCT能抑制IGF-1、IGF-1R mRNA的表達。由此推測，OCT可能通過抑制IGF-1，進而抑制PI3K/Akt信號通路，達到改善耐藥的目的。本研究對于臨床厄洛替尼耐藥患者的后續治療帶來了新的思路。

綜上所述，OCT可通過抑制IGF-1，進而通過抑制IGF-1R、PI3K-Akt信號通路來提高PC9/ER對厄洛替尼的敏感性。

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(本文編輯：王亞南)

江飛龍，韓靜，朱海振，等. 人肺腺癌厄洛替尼耐藥細胞PC9/ER的建立及奧曲肽改善耐藥機制研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(2)： 149-153.

·醫學動態·

沙門氏菌可用于殺滅癌細胞

近日，來自亞利桑那州立大學的研究者開發了一種遺傳修飾的沙門氏菌，其或可用于殺滅癌細胞。研究者Roy Curtiss博士表示，長期以來科學家都非常有興趣致力于利用遺傳工程化的微生物來靶向作用并且殺滅包括實體瘤在內的癌細胞，而本文研究中我們利用工程化的沙門氏菌實現了殺滅癌細胞的目的，這對于后期開發治療癌癥的個體化療法提供了新的線索和希望。

這項研究中，研究者通過修飾沙門氏菌的脂多糖(LPS)結構來使其變得低毒性，LPS是位于細菌外膜的一種結構，其也是引發敗血癥及致死性感染的罪魁禍首。研究者利用遺傳工程化技術對參與LPS合成的基因進行了剔除，隨后在裝有人類癌細胞的檢測管及攜帶腫瘤的小鼠機體中檢測了多種修飾的沙門氏菌的抗腫瘤效應。結果顯示，一種特殊突變的沙門氏菌菌株可以最有效地殺滅癌細胞，降低腫瘤進展，同時也不會引發機體患其它疾病，然而這種突變體在腫瘤中并不易于繁殖，盡管其達到腫瘤后可以表現出較強的殺癌細胞效應。為了解決這一問題，研究者隨后對菌株進行了另外一種遺傳修飾，即利用可誘導的阿拉伯糖啟動子，這種修飾可使得沙門氏菌在植入小鼠機體后不會損傷正常健康的細胞，同時還可以有效地在腫瘤組織中繁殖，并且有效殺滅癌細胞。在腫瘤組織中，沙門氏菌從不傷害正常細胞的良性侵襲性狀態向毒性狀態的轉變過程非常快，這取決于沙門氏菌進入腫瘤組織后發生的細胞分裂和菌株的快速生長。這項研究為后期開發以遺傳修飾化沙門氏菌為基礎的新型靶向療法來聯合化療及放療方法有效治療癌癥提供了新的研究線索和思路。

·論著·

【摘要】目的探討人肺腺癌耐厄洛替尼細胞系PC9/ER的耐藥機制，及奧曲肽(OCT)改善PC9/ER耐藥的可能機制。方法采用CCK-8法檢測PC9/ER的耐藥指數，奧曲肽(OCT)對PC9/ER改善耐藥的倍數，Western bolt方法比較PC9、PC9/ER及OCT作用后PC9/ER細胞IGF-1R、p-IGF-1R、Akt、p-Akt的表達。實時熒光定量PCR法檢測IGF-1，IGF-1R的mRNA表達量。酶聯免疫吸附方法(ELISA)檢測OCT作用后IGF-1的表達變化。結果PC9/ER的耐藥指數為10.4。厄洛替尼和OCT對PC9/ER的抑制作用增強，改善倍數為9.62。單獨用藥OCT可抑制PC9/ER細胞IGF-1，聯合用藥可抑制PC9/ER細胞IGF-1R、p-IGF-1R、Akt、p-Akt蛋白的表達。結論OCT可通過抑制IGF-1，進而通過抑制IGF-1R、PI3K-Akt信號通路來提高PC9/ER對厄洛替尼的敏感性。

【關鍵詞】肺腺癌；奧曲肽；厄洛替尼；耐藥；靶向治療

Octreotide reverses the resistance of erlotinib-resistant human lung adenocarcinoma cell line PC9/ER in vitroJiangfeilong,HanJing,ZhuHaizhen,ChenGuangpeng,ChenZhengtang.InstituteofCancer,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China

Correspondingauthor：ChenZhengtang,Email:czt05@163.com

【Abstract】ObjectiveTo research resistance mechanism of erlotinib-resistant human lung adenocarcinoma cell line PC9/ER, to detect the potential resistance reversal mechanism of octreotide(OCT) on PC9/ER. MethodsPC9/ER drug resistance index and reverse factor of OCT were measured by CCK-8 assay. Western blotting assay was used to observe IGF-1R, p-IGF-1R, Akt and p-Akt at protein level of PC9 and PC9/ER. PC9/ER was treated with erlotinib and OCT respectively, the changes of IGF-1R, p-IGF-1R were detected by western blotting assay and Real-time Quantitative PCR, OCT inhibition of IGF-1 was measured by ELISA. Resultsthe resistance index of PC9/ER to erlotinib was 10.4. OCT reversed drug resistance of drug resistance of PC9/ER, the reversal factor was 9.62. The combination of erlotinib and OCT inhibited protein expression of IGF-1R, p-IGF-1R, Akt, p-Akt. OCT has an inhibitory effect on IGF-1 secretion. ConclusionOCT can reverse the drug-resistance of PC9/ER by suppressing IGF-1 and IGF-1R.

【Key words】Lung adenocarcinoma;Octreotide;Erlotinib;Drug resistance;Targeted therapy

收稿日期：(2015-01-20)

文獻標識碼：中圖法分類號： R734 A

通訊作者：陳正堂，Email: czt05@163.com

基金項目：作者單位： 400037 重慶， 第三軍醫大學新橋醫院全軍腫瘤研究所

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.02.003