自體細胞生物化療在晚期非小細胞肺癌治療中的臨床應用

張露萍　閻呂軍　沈　杰　張　丹　孫建國

自體細胞生物化療在晚期非小細胞肺癌治療中的臨床應用

張露萍閻呂軍沈杰張丹孫建國

肺癌是人類第一大惡性腫瘤，2012年全球腫瘤流行病統計數據(GLOBOCAN2012)顯示世界范圍內診斷的最常見癌癥為肺癌(180萬)，最主要致死癌癥亦為肺癌(160萬)[1-2]。新增的肺癌患者中，80%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。目前，對NSCLC的治療仍以手術、化療、放療為主，盡管分子靶向治療(如：EGFR-TKI等)在過去幾年有很大發展，提高了部分特定患者的生存率，但總體上患者的5年生存率仍低于20%[3]，尤其是失去手術機會的晚期NSCLC患者預后更差[4-5]。因而，有必要對NSCLC進行更深入的研究，尋找更新、更有效的治療方法，以提高晚期患者的生存率和生活質量。

近年來，腫瘤免疫治療因其安全性高、副作用小越來越受到廣大醫生及患者的重視[6]。其中，以樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)和細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killers, CIKs)為基礎的細胞免疫治療已被廣泛用于多種惡性腫瘤的治療[4, 7]，是抗腫瘤過繼細胞免疫治療(adoptive cellular immunotherapy, ACI)的首選方案[7]。本研究采用試驗研究方法評價DC-CIK聯合化療對晚期NSCLC患者的臨床療效，旨在為晚期NSCLC患者提供新的治療思路。

資料與方法

一、一般資料

2012年9月至2014年9月期間，在我科住院治療的NSCLC患者，以明確的病理診斷、ⅢB/Ⅳ期、有可評價病灶、KPS≥70分、預計生存期>3個月、心肺肝腎骨髓功能基本正常者為入組標準。排除標準包括：①重要生命臟器(心、肺、肝、腎)嚴重功能障礙者；②曾接受過器官移植的患者；③有自身免疫性疾病史，過敏體質者；④嚴重感染的患者。以DC-CIK細胞聯合化療為治療組，有完整病歷者40例。同期中，以相同入組標準，接受單純化療的患者為對照組，共40例。患者一般資料，見表1。本研究方案獲得全軍總后勤部三類技術批準和第三軍醫大學倫理委員會同意。

二、制備DC-CIK細胞

化療前1 d用血細胞分離機采集患者自體外周血30～50 ml，用Ficoll密度梯度離心法收集外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)，生理鹽水洗3次，棄上清，用X-VIVO培養液重懸計數。鋪入六孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。孵育30 min后，每孔輕輕吹洗，吸出懸浮細胞加入CIKs培養基瓶中。再用鹽水洗板一次。加入DCs培養液每孔2 ml(X-VIVO培養液，同時加入GM-csF(2 μl/ml)、IL-4(2 μl/ml))，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。第3天半量換液。第5天，取樣進行細菌、真菌、內毒素檢測。第6天加入TNF-α(20 μl/孔)，同時加入腫瘤抗原：survivin、MUC-1、P53等，多肽終濃度為10 μg/ml；第7天收集DCs，同時取樣進行質量檢控；剩余DCs細胞凍存于-80 ℃冰箱中，分別在第11～14天復蘇后輸注給患者。

如前步驟收集單個核細胞，用X-VIVO培養液重懸計數，鋪入兩瓶提前配好的CIKs培養液中(培養液中加入IFN-α(50 μl/瓶)，CD3(500 μl/瓶)，IL-2(100萬IU/瓶))，每瓶1000 ml，再用50 ml注射器灌裝入2個細胞培養袋，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。第9和11天，抽樣進行細菌、真菌、內毒素檢測，第11和13天抽樣計活細胞和死細胞數。

三、治療方案

治療組：患者于化療前1 d進行外周血單個核細胞采集，于第1天開始化療。第11～14天回輸細胞，每天1次，連續4 d。DCs細胞于淋巴富集區域行多點注射，每次回輸細胞數量≥1×107；CIKs細胞行靜脈輸注，每次回輸細胞數量≥1×109，重懸到100 ml生理鹽水中，并取5 ml人血白蛋白注入到細胞懸液中混勻，1.5 h內輸注完成。對照組：行單純化療。治療組與對照組化療期間均輔以必要的保肝、止吐等對癥支持治療。

四、療效觀察指標

免疫功能評價：入組患者于治療前、后抽取外周靜脈血行T細胞亞群檢測，包括CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、CD3-CD56+NK細胞及CD4+/CD8+T細胞的比值。

表1　兩組NSCLC患者一般臨床資料(例)

注：兩組一般資料組間比較均無統計學差異，P>0.05

療效評價：2周期化療后行療效評價。所有患者治療前后行CT檢查，根據RECIST療效評價標準進行評價，分為完全緩解(complete remission, CR)、部分緩解(partial remission, PR)、疾病穩定(stable disease, SD)、疾病進展(disease progression, PD)。客觀緩解率(objective response rate, ORR)(CR+PR)，疾病控制率(disease control rate, DCR)(CR+PR+SD)。通過影像學檢查、電話隨訪，記錄患者的復發、轉移及生存情況。研究的主要終點事件為疾病進展，次要終點為死亡，計算出兩組無進展生存期(progression-free survival, PFS)及總生存期(overall survival, OS)。

安全性及生活質量評價：所有患者治療前后均行三大常規、肝腎功能、血生化等常規檢測，同時記錄患者的不良反應。并采用EORTC KPS評分量表評定患者生活質量。

五、 統計學方法

結果

一、 T細胞亞群變化

治療組與對照組治療前后的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD56+及CD4+/CD8+結果如表2所示。兩組T細胞亞群變化趨勢接近，兩組之間CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD56+及CD4+/CD8+比值相比較無統計學差異(P>0.05)，見表2。

二、臨床療效評價

1. 近期療效： 近期療效評價結果顯示，治療組40例患者中PR 5例，SD 31例，PD 4例，ORR達12.5%，DCR達90.0%。對照組40例患者中PR 2例，SD 27例，PD 11例，ORR為5.0%，DCR為72.5%。兩組ORR比較無顯著差異(χ2=0.626，P>0.05)，治療組DCR的比例顯著高于對照組(χ2=4.021，P<0.05)，見表3。

表3　兩組患者近期療效比較(%)

注：CR:完全緩解；PR：部分緩解；SD：疾病穩定；PD：疾病進展；ORR:客觀緩解率；DCR: 疾病控制率

2. 隨訪率： 治療組的中位隨訪時間分別為374 d，對照組為336 d。兩組隨訪率分別為92.5%和90%，治療組失訪3例，對照組失訪4例。治療組中位PFS為275 d，對照組為212 d，兩組PFS相比具有統計學差異(P<0.05)，見圖1。但兩組OS相比較無統計學差異(P>0.05)，見圖2。

圖1　晚期NSCLC患者兩組PFS比較，P<0.05

圖2　晚期NSCLC患者兩組OS比較，P>0.05

指 標治療組治療前治療后增加值對照組治療前治療后增加值P值CD3+(%)63.58±12.4366.94±11.353.36±1.6664.55±15.3266.32±14.631.77±4.46>0.05CD3+CD4+(%)35.26±10.6434.86±9.33-0.40±1.56 32.84±9.5228.88±11.32-4.00±2.71 >0.05CD3+CD8+(%)27.20±9.4730.77±10.093.57±1.1030.44±11.134.67±13.484.23±3.25>0.05CD4+/CD8+1.48±0.781.26±0.60-0.22±0.09 1.25±0.641.02±0.75-0.24±0.15 >0.05CD3-CD56+(%)22.13±12.0519.57±11.25-2.56±1.29 20.92±9.1719.75±11.24-0.02±2.23 >0.05

3. 生活質量的評價： 治療組與對照組治療前KPS評分分別為85±5.55、84.3±5.94，差異無統計學意義(P>0.05)。治療組KPS評分治療后提高10分以上者有9例(22.5%)，穩定29例(72.5%)，下降2例(5%)。對照組KPS評分提高者有4例(10%)，穩定27例(67.5%)，下降9例(22.5%)。治療組下降人數明顯少于對照組有統計學意義(χ2=5.165，P<0.05)。治療組95%患者自我感覺精神較前好轉，乏力減輕，食欲亦增加。

4.DC-CIK聯合化療的安全性評價: 治療組40例患者在DC-CIK治療過程中有5例出現發熱，最高體溫達38.5 ℃，持續約1～2 h，予以對癥處理后體溫恢復正常。2例患者出現輕度頭痛乏力，休息后自行緩解，持續時間不超過12 h，均可耐受。肝腎功能、血象、心肺功能等未見不良反應。

討論

近年來，NSCLC的發病率逐年上升，大多數患者經病理確診時已屬于晚期，失去了手術機會，只能進行以放化療為主的治療方法。但放化療引起的不良反應又使這些一般情況較差的晚期患者難以耐受。尋求新的治療方法來延長晚期NSCLC患者的生存期、改善生活質量，具有非常積極的意義。目前腫瘤的免疫治療發展迅速，它通過增強或調動機體免疫功能從而利用自身免疫系統抗擊腫瘤，延長患者的生存期[9-10]。

DCs細胞是已知體內最為重要的專職抗原遞呈細胞(antigen presenting cells, APCs)，它能攝取、加工、提呈抗原，刺激初始型T細胞活化與增殖[11-12]。通過大量體外活化培養負載腫瘤抗原的DCs細胞，再回輸給患者，可誘導機體產生強烈的抗腫瘤免疫反應[13]。CIKs細胞即細胞因子誘導的殺傷細胞，具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性及NKs細胞的非MHC限制性殺瘤特點，又被稱為NK細胞樣T淋巴細胞(NKT)[14]。DCs與CIKs兩者聯用可確保高效的免疫反應、增強殺瘤活性。大量體內外實驗均發現DCs與CIKs聯用可增強抗腫瘤效應[15-16]，可能有1+1>2的效果。目前這種聯用的治療方式已廣泛應用于臨床，或單獨使用或聯合放化療、靶向治療。Tao等[17]觀察了DCs與CIKs聯合應用于晚期實體腫瘤的療效，證明了DCs聯合CIKs是一種安全有效的治療方法，可以增強患者免疫功能。Wang等[18]采用DCs聯合CIKs的方法治療晚期腎癌，發現DCR與治療周期有明顯相關性(P<0.05)，但免疫學指標如T細胞亞群等無明顯改變。

傳統觀念認為，免疫治療與化療在功能上是相互拮抗的，不能一起應用。但近年來，研究發現化療與免疫治療聯合應用會起到增強療效的作用，即為生物化療[19]。部分化療藥物通過殺傷腫瘤細胞，令其釋放大量腫瘤抗原，提高腫瘤抗原的交叉提呈作用，從而誘導機體產生免疫應答[20]。如氟尿嘧啶、吉西他濱等化療藥可導致凋亡的腫瘤細胞具有強免疫原性，進而被DCs有效提呈給特異性T細胞，激活細胞毒性T細胞，產生強大的抗腫瘤效應[21-22]。Zhu等[7]分析了100例免疫治療聯合化療治療晚期結腸癌的臨床療效，發現DC-CIK免疫治療聯合化療組的OS長于單獨化療組(P<0.05)，且生活質量評分亦高于對照組。其它對胃癌、直腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的研究均有類似效果[23-24]。但如何使化療與免疫治療達到最有效的協同治療方式，還需要進一步深入研究。

我們采用自體免疫細胞生物化療的模式，研究結果顯示DC-CIK聯合化療的治療組在疾病控制率、無進展生存期方面明顯優于單純化療組(P<0.05)，且單純化療組KPS評分下降者明顯多于治療組，差異均具有統計學意義(P<0.05)。表明DC-CIK聯合化療能夠讓晚期NSCLC患者提高臨床獲益。但是在免疫指標的比較上，我們暫時沒有發現陽性結果，T細胞亞群各指標的統計也沒有明顯差異(P>0.05)，但是可以看到CD3+T細胞、CD8+T細胞都有上升趨勢，但還沒有達到統計學差異，可能與樣本量不夠有關。我們將在下一個研究中擴大樣本量，進一步探討其機制。

綜上所述，自體DC-CIK聯合化療能夠提高晚期NSCLC患者疾病控制率、延長無進展生存期，改善患者生活質量。DC-CIK是一種安全性高、不良反應小、綠色的治療方法，其潛力值得進一步開發。同時亦需大樣本量的臨床試驗進一步驗證療效，繼續觀察。

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(本文編輯：王亞南)

張露萍，閻呂軍，沈杰，等. 自體細胞生物化療在晚期非小細胞肺癌治療中的臨床應用[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(2)： 143-147.

·醫學動態·

美研究質疑癌癥患者腫瘤基因檢測準確性

隨著基因組測序成本快速下降，許多醫生開始根據對腫瘤的基因檢測結果來治療癌癥患者。但近日美國研究人員警告說，這種檢測會具有誤導性，約一半癌癥患者的治療可能不會有效果。研究人員解釋說，癌癥患者腫瘤中的許多基因突變實際上與癌癥并無關聯，它們是所謂的生殖系突變，即從父母那里遺傳而來，正常組織中也有這些突變，不過每個人的這種突變都不相同。因此，要更準確地確定致癌基因突變以指導治療，還需對癌癥患者的正常組織進行基因檢測。

負責研究的美國約翰斯·霍普金斯大學維克托·韋爾庫列斯庫教授說，對癌癥患者的腫瘤進行測序以提供個性化治療越來越流行，但許多這樣的檢測都沒有對患者的正常組織進行測序，沒有排除與癌癥不相關的突變。

在韋爾庫列斯庫等人的新研究中，他們比較了815人腫瘤組織與正常組織的基因組測序結果，這些人患有乳腺癌、肺癌、白血病等15種不同的癌癥，結果發現所檢測的三分之二的基因突變是假陽性結果，與癌癥無關，正常組織中也有它們的存在。研究人員進一步分析了“可作用基因”的突變情況，“可作用基因”是指被認為可作為癌癥藥物治療靶點的基因，結果發現其中的一半突變是假陽性結果。

腫瘤專家丹尼·赫力斯表示：基因組學顯示了我們身體里的“佐料”， 而蛋白質組學向我們顯示了用這些“佐料”有什么效果。理解我們身體里時時變化的蛋白質水平或許能幫我們了解癌癥是怎么發生的。

·論著·

【摘要】目的探討樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)和細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killers, CIKs)聯合化療對晚期非小細胞肺癌(NSCLC)患者的療效。方法DC-CIK細胞治療聯合化療的ⅢB期、Ⅳ期非小細胞肺癌患者為治療組，同期相同入組標準的單純化療者作為對照組。治療組和對照組各40例，比較兩組患者治療前后外周血T細胞亞群、臨床療效、生活質量變化等。結果兩組的一般資料基線水平一致。與對照組相比，治療組T細胞亞群變化無統計學意義(P>0.05)。治療組疾病控制率[DCR(90%)]明顯高于對照組DCR(72.5%)，差異具有統計學意義(P<0.05)。兩組中位無進展生存期(progression free survival, PFS)分別為275 d vs. 212 d，治療組PFS長于對照組(P<0.05)。但兩組間客觀緩解率(objective response rate, ORR)、總生存期(overall survival, OS)無統計學意義(P>0.05)。治療后生活質量(KPS)評分下降者，治療組較對照組少(P<0.05)，未見不可耐受不良反應。結論自體DC-CIK聯合化療的生物化療模式，可提高晚期NSCLC患者疾病控制率、延長無進展生存期，改善患者生活質量。

【關鍵詞】自體免疫細胞；非小細胞肺癌；T細胞亞群；生物化療

Clinical applications of autologous immune cells in the treatment of advanced non-small cell lung cancerZhangLuping,YanLyujun,ShenJie,ZhangDan,SunJianguo.InstituteofCancer,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China

Correspondingauthor：SunJianguo,Email:sunjg09@aliyun.com

【Abstract】ObjectiveTo explore the efficacy of dendritic cells (DCs) and cytokine-induced killers (CIKs) combined with chemotherapy in treatment of advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods Those advanced NSCLC patients (stages ⅢB to Ⅳ) who were treated with DC-CIK combined with chemotherapy were taken as the treatment group. Patients in control group were treated with chemotherapy only. The T cell subset, clinical effects and qualities of life in the two groups were compared. ResultsThere were 40 patients in each group, the baseline level of general information in the two groups were consistent (P>0.05). The T cell subset between the two groups has no significant difference (P>0.05). Compared with control group, the disease control rate (DCR) (reatment group, 90%; control group, 72.5%) and the progression free survival (PFS) (275 d vs. 212 d) in treatment group have clinical benefits (P<0.05). There was no statistically significant difference in the objective response rate (ORR) and the overall survival (OS) between the two groups (P>0.05). The performance status (Karnofsky, KPS) in treatment group was better than control group (P<0.05). And no severe adverse reactions were observed. Conclusion Autologous DC-CIK combined with chemotherapy can effectively enhance the DCR, prolong the PFS, and improve life qualities of advanced NSCLC patients.

【Key words】Autologous immune cells;Non-small cell lung cancer;T cell subset;Biochemotherapy

收稿日期：(2015-01-26)

文獻標識碼：中圖法分類號： R734 A

通訊作者：孫建國，Email: sunjg09@aliyun.com

基金項目：第三軍醫大學新橋醫院臨床科研基金項目(2011XLC38);作者單位： 400037 重慶，第三軍醫大學新橋醫院全軍腫瘤研究所

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.02.002