雞致病性大腸桿菌油乳劑滅活苗的制備

衛春曉劉俊玲.河南省濟源市動物衛生監督所，河南濟源459000；.河南省洛陽高新區畜牧獸醫防疫檢疫中心，河南洛陽47000

雞致病性大腸桿菌油乳劑滅活苗的制備

衛春曉1劉俊玲2
1.河南省濟源市動物衛生監督所，河南濟源459000；
2.河南省洛陽高新區畜牧獸醫防疫檢疫中心，河南洛陽471000

摘要從一雞場患病雞體內分離出1株雞致病性大腸桿菌，將分離的菌株擴增、滅活，制備成油乳劑滅活苗。對滅活苗進行物理性狀、安全性、保護力等檢驗，確認合格后，對雞場進行免疫，效果良好。該油乳劑滅活苗對本場雞有較好的保護作用。

關鍵詞雞；大腸桿菌；致病性；滅活苗

衛春曉，男，1987年生，助理獸醫師。

禽大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的急性或慢性傳染病。各種禽類均易感，各個品種、日齡的雞均可發病。隨著養殖場戶防疫意識的不斷提高，諸如新城疫等病毒性疫病基本得到有效控制。與此同時，細菌性疫病卻往往被忽略，特別是大腸桿菌病的發生和流行有越發嚴重的趨勢，給養禽業帶來巨大損失，而大腸桿菌的血清型極多，我國已報道的雞致病性血清型已有50個，且各血清型之間沒有或很少有交叉保護，給疫苗免疫帶來一定困難，相比之下，利用本場病死禽制備滅活苗針對性強，能得到較滿意效果。

1　材料與方法

1.1致病菌株

某雞場病死禽，典型包心、包肝變化。無菌采取病雞肝臟，37℃麥康凱瓊脂培養基上進行分離培養16 h后，挑取單個紫紅色菌落，再次接種于麥康凱瓊脂培養基上，經3次純化。

1.2菌種鑒定

1）形態特征。對分離到的菌株進行革蘭氏染色鏡檢。

2）生化試驗。對分離到的菌株進行生化試驗，包括五糖（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖）發酵試驗、M- R/V- P試驗、吲哚試驗和三糖鐵試驗。

3）致病性試驗。將分離的菌株用普通肉湯培養基培養24 h，培養物接種于5只成年小白鼠（腹腔注射，0.5 mL/只）。同時，另取5只成年小白鼠注射無菌生理鹽水作對照，觀察菌株對小白鼠的致病性。

1.3大腸桿菌油乳劑滅活疫苗的制備

1）菌株的培養。將分離的菌株接種于普通肉湯，37℃培養24 h，計數板菌落計數，菌液含菌量為1012個/mL，用滅菌生理鹽水菌液做10倍稀釋，使含菌量為百個每毫升。

2）水相制備。取上述菌液192 mL，逐級加入甲醛，使甲醛終濃度達到0.4%，37℃滅活48 h，經無菌檢查合格后，加入吐溫- 80 8 mL，混勻即為水相。

3）油相制備。分別稱取10號白油376 mL、司班- 80 24 mL、硬脂酸鋁8 g。先取少量白油，將硬脂酸鋁加入其中，充分混勻并加熱溶解，再與剩余白油及全部司班- 80混合均勻。121.5 P l16℃高壓滅菌30 min，即得到油相。

4）菌苗配制。按照l∶2的比例量取水相與油相，先將油相放入攪拌機，然后加入水相，10 000 r/min攪拌乳化5 min，即為油乳劑滅活苗。

1.4疫苗質量檢測

1）無菌試驗。取1 mL滅活苗用涂布棒均勻涂布于血清瓊脂平板上，37℃培養48 h。觀察是否有菌落生長。

2）物理性狀的檢測。

①穩定性檢測。取滅活苗5 mL，3 000 r/min離心10 min，觀察有無分層或破乳；

②乳化度檢測。取1滴滅活苗滴于蒸餾水表面，觀察是否擴散、消失。

3）安全性試驗。隨機選取5只成年小白鼠，于背部皮下分別注射滅活苗0.5 mL；同時設滅菌生理鹽水對照組5只。觀察實驗動物1周內的生長狀況。

4）保護力試驗。選15只成年小白鼠分為免疫組、生理鹽水對照組、感染對照組，每組5只。免疫組于第1天每只經背部皮下免疫接種滅活苗（0.5 mL/只），感染對照組接種等量生理鹽水，接種后第14天，免疫組、感染組小白鼠用24 h培養物攻擊，生理鹽水對照組經背部皮下每只注射0.5 mL滅菌生理鹽水，觀察1周內實驗動物生長情況。

2　結果

2.1菌種

培養物經3次純化傳代后，獲得1株菌株，革蘭氏染色呈陰性、中等大小桿菌；該菌株能夠分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇并產酸產氣，但不能利用蔗糖。M- R試驗和吲哚實驗均為陽性，V- P試驗陰性、不產生硫化氫。綜合判定，該菌株為大腸桿菌。

2.2致病性實驗

3 h后實驗組小白鼠精神開始萎靡，24 h內全部死亡。對照組全部健康存活。對小白鼠進行解剖，對比發現實驗組小白鼠肝臟、脾臟出現出血壞死，呈暗紅色，腸壁變薄，有出血點。取實驗組小鼠肝臟做涂片，染色鏡檢，分離培養得到大腸桿菌。

2.3油乳劑滅活疫苗的質量檢測

1）疫苗的無菌檢驗。油乳苗種于血清平板后，37℃培養48 h未見細菌生長。

2）疫苗的物理性狀。

①穩定性檢測。疫苗經3 000 r/min離心10 min后，為均質乳白色液體。

②乳化度檢測。點1滴滅活苗于蒸餾水表面，不向四周擴散，為油包水型。

3）疫苗的安全性。實驗小白鼠注射疫苗后，短時間內（6 h）表現精神沉郁，隨后觀察均無不良反應，采食、飲水正常。剖檢其注射部位也無異常，說明該劑量的油乳劑疫苗對試驗小白鼠是安全的。實驗小白鼠無異常反應。

4）免疫效力試驗。感染對照組小白鼠于24 h后全部死亡（死亡率為100%），免疫組于24 h后死亡1只，其余存活（死亡率為20%）。結果表明疫苗具有免疫保護作用。

2.4臨床應用效果觀察

該雞場1 500只產蛋雞經該疫苗免疫10日后，病雞死亡數量由每天10只以上，逐漸下降至零死亡，但產蛋率未恢復至發病前水平，考慮為病程久，對輸卵管損害較大的緣故。

3　討　論

致病性大腸桿菌是集約化養殖場的重要致病菌，且因其血清型多，型間交叉保護力差，使得疫苗免疫往往難以得到好的效果；采用抗生素預防與治療容易造成藥物殘留，并有產生耐藥菌株的情況。相比而言，該滅活苗有針對性強、保護力強、無殘留和低成本等優勢。但也應注意定期對雞場致病性大腸菌進行病原血檢測，不斷調整滅活苗中菌株的血清型，才能使疫苗免疫發揮更好的效果。

收稿日期：2015- 04- 28