影響無菌制劑無菌保證水平的因素

郭曉敏，彭先芬

(湖北科益藥業股份有限公司，武漢 430205)

影響無菌制劑無菌保證水平的因素

郭曉敏，彭先芬

(湖北科益藥業股份有限公司，武漢 430205)

探討提高無菌制劑無菌保證水平的可行性對策，以完善產品的質量保證體系，保證藥品的質量、療效和用藥安全。根據無菌制劑的特殊性、無菌檢查方法的局限性、無菌保證水平、無菌產品的工藝設計、無菌安全的保證要素幾個方面探討提高無菌安全水平的對策。注重無菌安全的保證要素，加強無菌制劑生產過程中的無菌控制是降低無菌制劑的質量風險和保障藥品質量的最有效的方法。

無菌制劑；無菌保證水平；無菌控制；質量保證體系

藥品是特殊商品，關系到人們的生命安全。《藥品生產質量管理規范》(good manufacturing practice，GMP)2010年修訂[1]附錄1無菌藥品第三條指出：“無菌藥品的生產必須嚴格按照精心設計并經驗證的方法及規程進行，產品的無菌或其他質量特性，決不能依賴于任何形式的最終處理或成品檢驗(包括無菌檢查)”。筆者從無菌制劑的特殊性、無菌檢查方法的局限性、無菌保證水平、無菌產品的工藝設計、無菌安全的保證要素幾個方面探討提高無菌安全水平的對策，以完善產品的質量保證體系，保證藥品的質量、療效和用藥安全。

1 無菌制劑的特殊性

無菌物品是指物品中不含任何活的微生物，實際上無法證明產品中沒有活的微生物存在，因為對于任何一批滅菌物品而言，絕對無菌既無法保證也無法用實驗來證實。一批物品的無菌特性只能通過對物品中活的微生物的概率低至某個可接受的水平來表達，即無菌保證水平[2](sterility assurance level，SAL)。實際生產過程中，滅菌是指將物品中污染的微生物概率降至預期的無菌保證水平。最終滅菌物品微生物存活概率，即無菌保證水平不得高于10-6。無菌制劑的生產是一個完整的操作規則體系，若其中的任何環節被疏忽、被污染，那么其他環節雖是無菌操作，也將完全失去意義，都可能導致藥品生產不符合質量要求。

2 無菌檢查法的局限性

無菌檢查法是根據《中華人民共和國藥典》內容而建立的一種檢查方法。若供試品符合無菌檢查法的規定，僅表明供試品在該檢驗條件下未發現微生物污染。檢驗結果只是基于“可能性”的判斷[3]，無菌檢查方法的局限性在于以下幾個方面。

2.1 培養液的質量 無菌檢查所用的培養液只是針對真菌和細菌的檢驗，對結果的判斷也是基于“是否在培養液中生長”。

2.2 培養條件 研究表明，《中華人民共和國藥典》規定的微生物培養條件并不是許多細菌和真菌的最適生長條件[4]。

2.3 實驗驗證 微生物的生長除了受培養液的質量、培養條件(溫度、時間)，還要受檢品特性如檢品有無抑菌作用、供試品的處理方法及實驗操作條件等因素的影響，因此要保證無菌檢查結果的準確性和可靠性就必須對無菌檢查的方法進行驗證。

2.4 檢驗數量 《中華人民共和國藥典》規定無菌檢查是抽樣檢查，一般是從每批產品中抽取一定數量的單位產品組成樣本進行無菌檢查，以此判斷整批產品是否符合無菌的要求。無菌產品的污染率(q)、無菌檢查的取樣量(n)以及無菌檢查通過的概率(p)之間的關系可以用如下數學公式表示：pn=(1-q)n。

當固定污染率為0.1%，抽樣30瓶時通過無菌檢查的通過率為(1-0.001)30=97.0%，檢出染菌的概率為3.0%；抽樣100瓶時，通過無菌檢查的通過率為(1-0.001)100=90.5%，檢出染菌的概率為9.5%；抽樣1 000瓶時，通過無菌檢查的通過率為(1-0.001)1 000=36.8%，檢出染菌的概率為63.2%。當固定30瓶取樣量，假定該產品的污染率為1.0%，通過計算，該批產品通過無菌檢查的通過率為74%；如果該產品的污染率為0.5%，則通過無菌檢查的通過率為86%。通過以上數據可以看出：樣本污染微生物的比例越低，抽樣樣本通過無菌檢查的通過率就越高，即使增大抽樣量也很難檢查出污染的部分。因為無菌檢查法是一項破壞性實驗，因此不可能對整批產品進行100%的檢驗，基于抽樣檢驗的無菌檢查，存在的局限性是很明顯的。雖然產品的無菌檢查按《中華人民共和國藥典》規定檢查合格，但不能得出產品絕對無菌的結論，這已是一個共識。

3 無菌保證水平

2010版《中華人民共和國藥典》將終端產品的無菌保證要求規定為微生物污染概率不超過百萬分之一，而采用無菌制造工藝，其無菌保證水平則為微生物污染概率不超過千分之一。以過濾除菌法為例。過濾除菌法[2]：常用于氣體、熱不穩定的藥品液體或原料的除菌。過濾過程中無菌保證與過濾液體的初始生物負荷及過濾器的對數下降值(log reduction value，LRV)有關，LRV系指規定條件下，被過濾液體過濾前的微生物數量與過濾后的微生物數量比的常用對數值。即：LRV=LgN0-LgN。

式中：N0為產品過濾前的微生物數量，N為產品過濾后的微生物數量。

每平方厘米有效過濾面積的LRV可以達到7，即過濾器上游每平方厘米有107個菌，下游可以達到1個菌的水平。除菌過濾器本身的除菌效率可以達到10-7水平，但是，由于人員操作及環境因素的影響，產品最終的無菌保證一般只能達到10-3水平，遠遠低于除菌過濾本身的水平。此外除菌過濾器不能將病毒或支原體全部濾除，所以對于除菌過濾法，其生產系統應嚴格符合無菌生產的GMP要求。GMP2010年修訂附錄1無菌藥品第五十二條：應當盡可能減少物料的微生物污染程度。第五十八條：應當根據所用滅菌方法的效果，確定滅菌前產品微生物污染水平的監控標準，并且定期監控。因此《藥品GMP指南》(無菌藥品，2010年修訂)在第6節藥液的配制中提出：對于固體溶解并進行無菌過濾的產品而言，起始物料的微生物污染水平應進行控制，通常為100 cfu·g-1[菌落形成單位數(colony forming units，cfu)]，除菌過濾前非最終滅菌產品的微生物限度標準一般為10 cfu/100 mL。

4 無菌產品的工藝設計

無菌生產工藝就是必須在無菌控制條件下生產無菌制劑的方法，無菌產品分兩大類即無菌分裝的產品和最終滅菌的產品。無論是哪一類無菌產品，無菌生產工藝都應嚴密監控生產環境的潔凈度，并應在無菌控制的環境下才能操作。采用無菌生產工藝，首先在劑型的選擇上應選擇無菌保證水平高的劑型。如果主藥在水中穩定，但不能耐受濕熱滅菌，則不宜開發成大容量注射劑，可以開發成小容量注射劑或凍干粉針，因為采用無菌生產工藝制備大容量注射劑因灌裝時間長，染菌的風險就大大提高。在其生產過程中，應定期對無菌生產工藝進行驗證，驗證內容包括環境空氣過濾系統有效性、工藝用水系統、設備和人員清潔及培養液模擬灌裝實驗等。

5 無菌安全的保證要素

無菌安全實際上就是避免染菌，如果在生產過程中能避免已滅菌的容器設備等受到二次污染就能保證產品的無菌安全。微生物的來源主要有以下3種。

5.1 人員 人是潔凈區環境的最大污染源，因為人員幾乎涉及到所有的生產步驟，人員的活動量將直接影響整個潔凈區的環境質量，在無菌室由操作人員引起的污染將達到總污染原因的95%[5]。研究表明[6]，潔凈室內的工作人員穿無菌服時，靜止狀態的發菌量一般為每人每分鐘10～300個，軀體一般活動狀態為每人每分鐘150～1 000個，快步行走狀態為每人每分鐘900～2 500個，咳嗽一次一般為每人每分鐘70～700個，噴嚏一次一般為每人每分鐘4 000～62 000個。通過對上海地區無菌藥品生產企業的核心生產區(即動態A/B或A/C級)環境中微生物的污染采樣，共收集到微生物分離株265株，A級區共收集到63株，占污染微生物總數的23.8%，在A級區的微生物污染物類型較多、較復雜。不同潔凈級別區域之間的空氣微生物污染程度由低級別向高級別遞減，但表面微生物污染程度在各潔凈級別之間的差異不大。這說明空氣凈化和物理隔離可以有效阻斷大部分微生物的傳播，但接觸和操作引起的污染仍是生產企業面臨的主要問題[7]。

5.2 工藝用水 注射用水與注射劑在生產過程中污染可能性最高的發熱性物質就是細菌內毒素。細菌內毒素由革蘭陰性菌產生，而水源性微生物絕大多數為革蘭陰性菌，這類微生物不會形成芽孢，故不耐熱，通過滅菌手段可將其殺死，但該類細菌的細胞壁外層上有一層特殊的結構，它在細菌生長繁殖過程中并不分泌到介質中，也不能從外壁上自然脫落，不是細菌的代謝產物，當細菌死亡、解體后才顯示出一系列內毒素的生物活性。細菌內毒素具有耐熱性，需用干熱滅菌(250 ℃，30 min以上)才能去除。細菌內毒素會使人致病甚至死亡，對藥品質量產生不良的影響。

5.3 環境 空氣中的微生物基本為革蘭陽性菌，根據有關的資料報道[7]：人葡萄球菌和唾液鏈球菌為人體攜帶的常見菌種，而沃氏葡萄球菌、藤黃微球菌和芽孢桿菌均為常見環境菌。產生芽孢的細菌都是革蘭陽性菌[7]，芽孢對熱、干燥、輻射、化學、消毒劑等理化因素均有強大的抵抗力，其中含有吡啶二羧酸鈣，更增加了對熱的抵抗力。如果芽孢被環境中的塵埃包圍，這類芽孢的耐熱性可能會更強，更不易被殺死。

6 提高無菌安全水平的對策

6.1 重視無菌檢查法的方法學驗證 無菌檢查法常見的問題[8]：對檢驗方法的驗證、培養時間的選擇和結果判斷缺乏系統的評價。所以，應綜合分析實驗中遇到的所有情況，最終形成一份詳細的、嚴謹、具有可操作性的驗證報告，并且建立該品種的標準操作規程(standard operation procedure，SOP)，在規程中應對樣品的取樣量、無菌檢查方法的選擇、集菌培養器的型號、稀釋劑及沖洗液的選擇、每次沖洗液的用量和沖洗次數都應有說明。研究表明[9]，同一品種使用適于抗菌性供試品專用培養器(KSF330，0.45 μm)比使用適于非抗菌性供試品普通培養器(CN330，0.22 μm；PY330，0.45 μm)所需沖洗量少一半；不同的品種所需的沖洗量不同，選擇不同的沖洗液所需的沖洗量不同。對待無菌檢查結果要進行科學分析，如果無菌檢查結果合格，不能得出該批產品絕對無菌的結論，如果無菌檢查不合格，則可以判定該批產品染菌的結論。不能出現假陰性(陽性對照為陰性)時漏檢，當結果為陽性時，違反《中華人民共和國藥典》規定進行復檢。

6.2 全面、細致、周到的質量管理 目前已經過了GMP認證的無菌制劑生產企業，均建立了完善的質量管理體系和一系列管理制度。但任何一項規章制度都無法阻止違規現象的發生，能否有效執行是關鍵。在生產中可能會出現很多違規現象，但是在管理方面卻沒有任何的證據。例如對傳遞窗使用的管理，傳遞窗的作用就是防止物品在傳遞過程中受到污染和避免交叉污染，對傳遞窗的使用有幾個要求：傳遞窗的自凈時間、紫外線的照度及照射時間。而現在多數的傳遞窗的按鈕設置就是一個最基本的電源開關，工作人員自行操作時會嚴格按標準操作規程執行嗎？如自凈時間確認為30 min，有些操作人員為了趕時間，只用15 min。再例如，對于無菌操作間，進入人員的數量是有嚴格規定的，但有時車間為了趕進度或由于其他原因可能會增加人數，這些操作都是違規的，所以為了能全面、細致、周到地執行和實施GMP，建議從以下幾個方面進行改進。

6.2.1 人員培訓 GMP培訓是提高藥品生產企業人員素質的有效手段，人員素質的不斷提高是保證藥品質量的基礎。應對員工開展各類培訓，對不同員工所在崗位需要掌握的知識和技能進行針對性培訓，對培訓效果進行考核。保障員工掌握本崗位的基本理論知識、操作規程和實際操作技能。同時，要經常對員工進行藥害事件的宣傳教育工作，增強責任心，使其在工作中自覺地按照標準操作規程操作[10]。無菌藥品的微生物污染是影響藥品生產質量和引發不良反應事件的主要因素之一。微生物是無處不在、無孔不入的，反復進行無菌概念的培訓是加強無菌概念的有效辦法。反思現行的無菌培訓，內容多是微生物學和進出潔凈室的規程，由于操作規程中不可能事無巨細，員工在實際生產中遇到規程中沒有規定的情況，常常會違反無菌操作的原則[11]。特別要加強對外部施工人員和維修人員的培訓工作，當他們在生產期間需進入生產潔凈區時應當對其進行詳細的指導和監督。在實際生產中，往往會出現這樣的情況，當設備出現小故障時，為了使生產能正常進行，或者出于迫切完成任務的考慮，維修人員會做出一些違規動作，如果沒有較強的無菌概念，就會導致污染。

6.2.2 工藝用水 有效控制水系統的微生物污染水平及細菌內毒素的水平，企業內部應設立警戒水平及糾偏限度，以便及時發現不良趨勢，采取相應措施。

6.2.3 環境管理 環境管理的主要思想是防止污染和交叉污染。生產環境包括：空氣、設備、設施以及操作人員。環境監測是用來評估生產環境控制是否有效的一個工具。檢測項目包括懸浮粒子、空氣浮游菌、沉降菌、設備和設施表面的微生物以及操作人員的衛生狀況監測等。環境中懸浮粒子的有效控制，在很大程度上解除了塵埃包裹芽孢的可能，避免了難以滅菌的風險。沉降菌、浮游菌及表面微生物這3種監測的原理是不同的，針對不同的微生物，不能完全相互替代。通過對潔凈室/區空氣、設備、設施表面以及操作人員表面微生物的采集，除了通過菌落計數了解微生物的濃度外，還應包括對培養出來的污染微生物進行鑒別，通過鑒別可了解潔凈室的清潔、消毒步驟的有效性或缺陷性，特別是對消毒劑有效性評估有所幫助，微生物鑒別的結果也對調查和消除污染源有幫助。

6.2.4 設備的管理 在企業的生產過程中，設備與設施如同戰場上的武器一樣，平時必須要注重保養和維護，并且要制定有效的短、中期維修計劃，確保設備正常運行，這樣才能在實際操作中發揮良好的作用，不會給生產帶來負面影響。

6.3 注重無菌生產工藝驗證 要定期進行培養液模擬灌裝驗證，證明經過完整的生產過程，產品污染率的目標為零。培養液模擬灌裝在某種意義上是一種挑戰性實驗，使用培養液作為藥品的替代品進行無菌模擬生產，對無菌工藝進行驗證。因為幾乎在所有情況下，微生物在培養液中的繁殖和生長比在實際產品中更容易。GMP(2010年修訂)附錄1無菌藥品中第四十七條提出：培養液模擬灌裝實驗的首次驗證，每班次應當連續進行3次合格實驗，空氣凈化系統、設備、生產工藝及人員重大變更后，應當重復進行培養液模擬灌裝實驗，培養液模擬灌裝實驗通常應當按照生產工藝每班次半年進行一次，每次至少一批。

6.4 現場監督 現場監督是質量保證(quality assurance，QA)的一部分。QA就是為了滿足品質的要求而進行的全面有效的質量管理活動。QA人員的主要職責就是對生產全過程進行控制，糾正生產過程中出現的差錯及不規范行為，做到防患于未然。QA人員工作的性質就是要找別人的缺點與不足，為了起到警示作用還必須對不規范行為進行扣罰。QA人員最容易犯的錯誤就是遇見問題總是搬出文件規定，命令操作人員執行，當生產過程中出現異常情況時也只會讓操作人員停下來并且一味強調要如何處分或者威脅當事人，這樣說和做的結果不僅不能解決問題，反而會增加當事人對QA人員的反感，以后QA人員的管理工作會更難開展。更可怕的是操作人員會有意隱瞞生產現場的任何問題，這樣一來質量風險會越來越大。GMP規范和《中國人民共和國藥典》的標準是不可逾越的，為此需要尋找各種可行的辦法，所以要求QA人員必須具有理論知識和實踐經驗，既精通GMP法規，熟知生產工藝，又要懂得設備的操作，并且還要具有良好的與人溝通的能力。在現場發現問題時，QA人員能和操作人員共同分析問題，從根本上幫助操作人員解決問題，得到操作人員的理解和尊重，這樣才能使QA工作進入良性循環。

7 結束語

無菌制劑的特殊性決定了其生產過程的高風險性，無菌檢查法的局限性也決定了無菌制劑沒有絕對的無菌保證。藥品生產者必須遵守現行藥品生產質量管理規范，進行無菌生產工藝的驗證，擁有良好廠房設計，重視員工的培訓，才能取得高水平的無菌保障[4]。

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[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄190-191.

[3] 蘇德模，馬緒榮.藥品微生物學檢驗技術[M].北京：華齡出版社，2007：97，259-260.

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[10] 徐大兵，陳俊，崔菊霞，等.藥品生產企業質量管理體系的合理設置[J].中國藥事，2014，28(7)：732-734.

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《亞太傳統醫藥》雜志征稿征訂啟事

《亞太傳統醫藥》雜志是由國家新聞出版廣電總局批準公開發行的學術期刊，國內統一刊號：CN 42-1727/R，國際刊號：ISSN 1673-2197，郵發代號：38-143。由湖北省科學技術廳主管，中國民族醫藥學會、湖北省科技信息研究院主辦，內容以傳統醫藥，尤其是中醫藥、民族醫藥的繼承與發展為重點，關注行業熱點、重點、難點，介紹中國及亞太各國傳統醫藥的經驗、理論與實踐，促進國際學術交流合作。主要欄目有：發展論壇、基礎研究、傳統醫藥文化、國際傳統醫藥、民族醫藥、藥學研究、臨證經驗、臨床研究、藥物與臨床、醫學教育、藥事管理、專論與綜述等。該刊是關于亞太地區傳統醫藥行業發展與學術期刊，聯合國亞太技術轉讓中心、國家科技部、國家中醫藥管理局傳統醫藥國際交流期刊，《中國期刊全文數據庫》《中文科技期刊數據庫》《中國核心期刊(遴選)數據庫》收錄期刊。

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2014-05-21

2014-10-25

郭曉敏(1964-)，女，河南洛陽人，副高級工程師，學士，主要從事藥品的微生物檢驗及方法學驗證工作。電話：(0)15927067161，E-mail：1728026988@qq.com。

R943；R927.1

B

1004-0781(2015)09-1220-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.028