輸血前血液篩查中新型HBV基因突變及抗原分析的研究

孫玲玲，孫偉峰，張　震（通訊作者）（南京醫(yī)科大學附屬無錫市人民醫(yī)院　輸血科；南京醫(yī)科大學附屬無錫市人民醫(yī)院　醫(yī)學檢驗科；無錫市中心血站，江蘇無錫40）

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輸血前血液篩查中新型HBV基因突變及抗原分析的研究

孫玲玲1，孫偉峰2，張震3（通訊作者）
（1南京醫(yī)科大學附屬無錫市人民醫(yī)院輸血科；2南京醫(yī)科大學附屬無錫市人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科；3無錫市中心血站，江蘇無錫214023）

〔摘要〕目的：分析研究輸血前血液篩查中新型HBV基因突變及抗原特點，評價核酸檢測技術（NAT）在輸血前檢查中的應用價值。方法：選取我血液中心采集的血液標本40421份，采血并進行ELISA、ALT、血型檢測、NAT檢查，ELISA采用雙抗原夾心法檢測抗原、抗體，NAT檢查采用全自動生化檢驗，以病毒核酸提取試劑盒提取血清標本病毒DNA，進行PCR擴增、產物純化，進行DNA測序、序列分析，對于ELISA （-），NAT（＋）獻血者進行跟隨隨訪，分析乙肝表面抗原變化情況。結果：ELISA篩查HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2中有1項為反應性標本占96.99%，NAT檢查陽性率7.92×10-4（31/40421），10例HBV/HCV/ HIV陰性，HBV DNA反應性占70.00%，21例HBV DNA反應性標本，病毒含量11～84IU/ml，平均（15.5±2.3）IU/ml；隨訪12個月以上，25例隨訪1～5個月，HBsAg抗原轉為陽性1例、HBV NAT檢查轉為陰性3例，維持原樣21例，乙肝窗口期3例、隱匿性感染12例，對血樣進行乙肝“兩對半”檢查，其中HBsAg陽性1例、HBcAb陽性21例、HBsAb陽性13例、HBcAb單陽性6例，隨訪變?yōu)?、17、12、3例。結論：輸血前血液篩查中新型HBV基因突變可能是致抗原陰性的重要原因，進行NAT檢查有助于發(fā)現(xiàn)窗口期、隱匿性HBV感染。

〔關鍵詞〕乙型肝炎病毒；肝炎；輸血；血液篩查；基因突變；抗原分析

輸血是臨床常用的治療手段，挽救了數(shù)以億例患者生命。乙型病毒性肝炎是一種以乙型肝炎病毒（HBV）為病原體的傳染病，我國是乙肝高發(fā)國家，乙肝表面抗原攜帶率高達10%～11%，其中相當一部分無特異性癥狀表現(xiàn)，為隱性感染，輸血前進行乙肝檢驗非常必要，有助于保障輸血安全[1]。ELISA是檢查HBsAg主要方法，但靈敏度較低，近年來核酸檢測技術（NAT）逐漸受到醫(yī)學界重視，敏感度高，可有效提高感染“窗口期”檢出率，發(fā)現(xiàn)隱匿性感染、病毒變異株。我市中心血站對無償獻血血樣開展NAT檢查，現(xiàn)報道如下。

1　資料及方法

1.1一般資料

2012年1月至2013年12月，血液中心采集的血液標本40421份，采血并進行ELISA、ALT、血型檢測、NAT檢查。

1.2方法

血液標本2～8℃冰箱保存，4h內，1500 g離心20 min，分離血漿，2～8 ℃冰箱保存，完成各項檢測。ELISA采用雙抗原夾心法檢測抗原、抗體，NAT檢查采用全自動生化檢驗，ELISA測定HBsAg陰性、抗HCVAb陰性、抗HIVAb陰性樣品，并對三項標本進行三項病原體檢測，提取核酸，以擴增檢測系統(tǒng)檢測標本。以病毒核酸提取試劑盒提取血清標本病毒DNA，進行PCR擴增、產物純化，進行DNA測序、序列分析。對于ELISA（-），NAT（＋）獻血者進行跟隨隨訪，分析乙肝病毒表面抗原變化情況。對以上說的HBsAg ELISA（-）、NAT（＋）標本，以電化學發(fā)光法進行乙肝五項檢查，并評價乙肝病毒感染免疫情況，合適NAT抗體表達，診斷是否為窗口期、隱匿性感染[2]。

1.3統(tǒng)計學處理

2　結果

2.1基本情況

40421份檢查，ELISA篩查HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2中有1項為反應性標本39 204份，經NAT檢查，見31例反應性標本，檢出率為7.92×10-4，進行復檢，NAT檢查仍為陽性，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2中結果無變化。將31例標本送檢，10例HBV/HCV/HIV陰性，21例HBV DNA反應性，占70.00%，檢出病毒，且病毒為HBV，HCV RNA、HIV RNA為陰性。21例HBV DNA反應性標本，病毒含量11～84 IU/ml，平均（15.5±2.3）IU/ml，其中<20 IU/ml者20例，占95.24%。40 421份樣本中，ELISA檢查HBsAg陽性1782份，檢出率4.41%，雙試劑反應陽性1108份，占2.84%、單試劑反應陽性624例，占1.54%[3]。

31例NAT反應性標本進行PCR擴增，8例電泳見特異性條帶，其余擴增反應不佳，產物量較小。對31例ELISA（-），NAT（＋）獻血者進行跟隨隨訪，隨訪12個月以上，其中6例失訪，25例隨訪1～5個月，其中ELISA檢查HBsAg抗原轉為陽性1例、HBV NAT檢查轉為陰性3例，維持原樣21例。后經診斷，乙肝窗口期3例、隱匿性感染12例[4]。

2.2抗體檢測

31份ELISA（-），NAT（＋）獻血者，對血樣進行乙肝“兩對半”檢查，其中HBsAg陽性1例、HBcAb陽性21例、HBsAb陽性13例、HBcAb單陽性6例。隨訪，再次取對象血樣，復查，HBsAg陽性3例、HBcAb陽性17例、HBsAb12例、HBcAb單陽性3例。

2.3典型病例

1例確定為窗口期標本，首次HBV、HCV、HIV，重復檢查均顯示正常，NAT檢查陽性，為“窗口期”，Ct=33.4。跟蹤隨訪1周，復查，進行HBV、HCV、HIV核酸檢測，Ct=30.1，病毒拷貝可能增多，但進行電化學發(fā)光法進行乙肝五項、HCV、HIV檢查，仍為陰性。繼續(xù)隨訪，第6周，復查HBV、HCV、HIV核酸檢測仍為陰性，Ct=23.2，乙肝五項檢查，HBsAg、HBeAg轉為陽性，診斷為乙肝感染，傳染性增強。第12周復查，混樣模式檢查HBV、HCV、HIV核酸，Ct=28.4，又發(fā)生變化，電化學發(fā)光檢查HBeAb為陽性，HBsAg轉為陰性，乙肝病毒復制不活躍，提示HIV感染時間已較長，病毒趨于穩(wěn)定，HBVDNA可能與宿主DNA開始或已經整合。

3　討論

輸血安全關系個人生命健康安全，輸血所致感染是醫(yī)療糾紛發(fā)生重要原因之一，臨床上常以兩次酶聯(lián)免疫吸附法進行病毒檢測，但實際情況是，因HBV窗口期較長、假反應性較高等原因，仍有少部分被漏診，攜帶HIV病毒血液被輸注，受血者被感染。血液感染主要原因包括為病毒感染窗口期獻血、病毒變異、隱匿感染輸血、實驗室差錯[5]，我國因各地區(qū)輸血安全管理水平參差不齊、個人輸血安全意識較差，血液病毒殘存率較高，本組患者ELISA篩查HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2中有1項為反應性標本占96.99%，不合格者占3.01%，血液質量亟待提高。經NAT檢查發(fā)現(xiàn)，ELISA（-）、NAT（＋）陽性率7.92×10-4（31/40 421），提示單純的ELISA三聯(lián)檢測仍不能完全保證血液合格。研究顯示，ELISA（-）、NAT（＋）陽性者，HBV DNA反應性占70.00%，其中病毒含量11～84IU/ml，平均（15.5±2.3）IU/ml，提示NAT可檢出隱匿性、窗口期乙肝病毒感染，隱匿性感染可能與基因突變有關，后經隨訪證實，乙肝“兩對半”檢查，血樣HBsAg陽性1例、HBcAb陽性21例、HBsAb陽性13例、HBcAb單陽性6例，隨訪變?yōu)?、17、12、3例，患者病毒活躍性發(fā)生變化。

第四代酶聯(lián)免疫吸附測試已可將輸血風險將至1/100萬級，但技術本身存在一定缺陷，盡管檢測抗原、抗體，窗口期、潛伏期患者獻血仍無法避免，造成漏檢，NAT檢測已成為部分發(fā)達國家傳染病篩查重要方法，但因成本、價格等原因尚未得到普及，但該技術仍有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

［參考文獻］

［1］ 王曉軍，張榮珍，胡苑笙，等.我國病毒性肝炎流行現(xiàn)狀研究[J].疾病監(jiān)測2014，29（8）：290-292.

［2］ 林宇，李頌華，王如偉.日本對慢性乙型肝炎和肝硬化的治療研究概述[J].中國藥學雜志，2012，47（18）：1444-1449.

［3］ 中華醫(yī)學會感染病學分會，中華醫(yī)學會肝病學分會.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）[J].中國預防醫(yī)學雜志，2011，12（1）：1-15.

［4］ 張梅香.輸血前傳染病檢測在輸血中的應用價值探究[J]. 數(shù)理醫(yī)藥學雜志，2014，（06）：735-736.

［5］ 冷嬋.血液HCV篩查策略的探討[D].北京：軍事醫(yī)學科學院，2012.

收稿日期：2015-06-21

〔中圖分類號〕R575；R512.6+2

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1002-2376（2015）10-0100-02