HPLC-MS/MS法同時測定補腎壯陽類保健食品中非法添加11種化藥成分

朱 捷，何 微，馬桂娟

（寧夏回族自治區(qū)食品檢測中心，寧夏 銀川 750004）

HPLC-MS/MS法同時測定補腎壯陽類保健食品中非法添加11種化藥成分

朱 捷，何 微，馬桂娟

（寧夏回族自治區(qū)食品檢測中心，寧夏 銀川 750004）

建立高效液相色譜法及串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定補腎壯陽類保健食品中非法添加11種化藥成分。采用高效液相色譜法考察線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性以及回收率。采用scan、sim及product ion的掃描方式對11種化合物進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。結(jié)果11種化藥成分峰面積與濃度之間線性關(guān)系良好（r≥0.999 9），各組分回收率在96.8%～100.5%之間，穩(wěn)定性、精密度良好。采用優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)試驗，各組份分離度良好，MRM方式準(zhǔn)確快速。結(jié)論 該法準(zhǔn)確快速，適用于補腎壯陽類保健食品非法添加的定性、定量測定以及快速篩查工作。

保健食品; 非法添加; MRM; 快速篩查

保健食品能調(diào)節(jié)人體的機能，適宜于特定人群食用。但隨著該市場的持續(xù)發(fā)酵，不法商家為求高額利潤，向產(chǎn)品中有針對性的添加不同種類的化學(xué)藥品，從而提高其產(chǎn)品的療效。消費者服用后，這些化藥成分可在短期內(nèi)降低病理指標(biāo)，但消費者在不知情的情況下長時間、大劑量的服用會對肝、腎、心臟造成巨大損傷。國家食品藥品監(jiān)督管理局早在2009年就針對該市場的亂象進(jìn)行有針對的治理。

那非類化藥對于補腎壯陽，治療男性性功能障礙有著非常好的療效，國家食品藥品監(jiān)督管理局也針對該類保健食品制定了藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準(zhǔn)件，目的就是為了快速篩查和驗證保健食品中是否添加此類化藥。目前已有較多學(xué)者進(jìn)行了該類化藥的研究[1-3]，但研究多針單一品種化藥的非法添加以及部分研究缺少定量方面的考慮，或是研究方法未優(yōu)化。而該類藥物不斷更新，在2009年又發(fā)現(xiàn)了新型羥基豪莫西地那非[4]。本文參照國家局文件中規(guī)定的11種那非類化藥的檢測方法，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行系統(tǒng)的研究，優(yōu)化定性、定量方法參數(shù)，補充穩(wěn)定性等方法學(xué)驗證，并為今后對該類保健食品的快檢工作以及檢測方案修訂工作提供一定的參考。

1 實驗部分

1.1 儀器

三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（Agilent 6460C）、高效液相色譜儀（Agilent 1260）、分析天平、超聲波清洗機。

1.2 試劑

甲醇（Fisher HPLC）、乙腈（Fisher HPLC）、磷酸（Fisher HPLC）、乙酸銨（Sigma），水為超純水。那紅地那非（批號：520039-201401 中檢院）、紅地那非（批號：520047-201401中檢院）、氨基他達(dá)拉非（批號：520042-201401中檢院）、他達(dá)拉非（批號：1156-051A1 TLC醫(yī)藥化工有限公司）、枸櫞酸羥基豪莫西地那非（批號：510032-201301中檢院）、西地那非（批號：510068-201401中檢院）、豪莫西地那非（批號：520046-201401中檢院）、偽伐地那非（批號：520041-201401中檢院）、那莫西地那非（批號：520040-201401中檢院）、硫代艾地那非（批號：520048-201401中檢院）、伐地那非（批號：1132-035A1 TLC醫(yī)藥化工有限公司）。補腎膠囊（九牛葆膠囊 寧夏自然生物科技有限公司 3批）。

2 實驗方法

2.1 高效液相色譜法

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6 mm×250 mm 5μm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10μ L，柱溫35 ℃，檢測波長230 nm，帶寬4 nm，流動相A：磷酸三乙胺溶液：甲醇：乙腈（60:20:20），流動相B：磷酸三乙胺溶液：甲醇：乙腈（8:46:46），梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Table 1 HPLC gradient elution program

2.1.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取那紅地那非對照品9.73 mg、紅地那非對照品10.27 mg、氨基他達(dá)拉非對照品10.41 mg、他達(dá)拉非對照品6.90 mg、枸櫞酸羥基豪莫西地那非對照品13.6 mg、西地那非對照品10.43 mg、豪莫西地那非對照品10.21 mg、偽伐地那非對照品10.00 mg、那莫西地那非對照品10.17 mg、硫代艾地那非對照品10.43 mg、伐地那非對照品7.10 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇制成混合對照品溶液。另取各對照品適量，加甲醇制成約0.3 mg/mL的單標(biāo)溶液。

2.1.3 線性關(guān)系的考察

精密吸取混合對照溶液0.05、0.1、0.25、0.5、1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加流動相稀釋制成約5.0、10.0、25.0、50.0、100.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1項下的色譜條件考察線性關(guān)系。

2.1.4 樣品溶液的制備

取膠囊內(nèi)容物,精密稱定,至于50 mL容量瓶中,加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度,制成mg/mL的溶液，用0.22μm的濾膜過濾，測定。

2.1.5 精密度試驗

取線性關(guān)系考察中25.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算RSD%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗

取線性關(guān)系考察中25.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于0、2、4、6、12、24小時測定，計算RSD%。2.1.7 加標(biāo)回收試驗

按2.1.4項下方法制備樣品溶液，向其中加入混合對照品溶液0.5 mL，用甲醇定容至50 mL，同時制備6組平行樣，測定。

2.2 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 2.1 mm×10 mm 3.5μm、流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量10 μ L、柱溫35 ℃、流動相A：甲醇（含15%乙腈），流動相B：0.02 mol/L乙酸銨溶液（含0.1%乙酸、15%乙腈），梯度洗脫程序見表2。正離子掃描，掃描范圍50～600 amu，離子源溫度：300 ℃、鞘氣溫度：350 ℃、干燥氣流速6 L/min、噴嘴壓力45 psi、鞘氣流速12 L/min。

表2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜梯度洗脫程序Table 2 HPLC-MS/MS gradient elution program

2.2.2 對照品溶液的制備

取2.1.2項下混合對照溶液，加流動相制成約1 μg/mL的混合對照品工作液，另取各物質(zhì)單標(biāo)溶液，加流動相制成約1μg/mL的單標(biāo)對照品工作溶液。

2.2.3 母離子掃描

采用正離子掃描模式分別取單標(biāo)對照品工作溶液進(jìn)行母離子掃描，掃描范圍50～600。設(shè)置不同F(xiàn)ragment電壓，優(yōu)化Fragment電壓。另取混合對照品工作液，按優(yōu)化后條件測定。

2.2.4 子離子掃描

分別取單標(biāo)對照品工作溶液進(jìn)行子離子掃描，掃描范圍50～600。設(shè)置不同碰撞電壓，找出特征碎片離子最豐富的CE電壓。另取混合對照品工作液，按優(yōu)化后條件測定。

2.2.5 MRM

采用優(yōu)化后的質(zhì)譜條件，選取各化合物的特征子離子作為定性離子，設(shè)置離子對，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）的測定。

3 試驗結(jié)果

3.1 高效液相色譜法

采用優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行11種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析,使用各藥物單標(biāo)進(jìn)行定位,結(jié)果見圖1 ,由圖1可以看出，各峰峰形及分離度良好,說明采用優(yōu)化后的色譜條件適合11種藥物的同時分離，同時由表3可以看出各化合物的線性關(guān)系良好。

圖1 11種化合物的HPLC圖Fig.1 The HPLC figure of 11 kinds of compounds

精密度實驗中，各藥物峰面積RSD%為0.08%～0.23%，表明該方法精密度是良好的。穩(wěn)定性實驗中，隨著測定時間的延長，各藥物保留時間無明顯變化，峰面積RSD%為0.12%～0.21%，表明在該方法測定條件下，測定結(jié)果是穩(wěn)定的。各組分加標(biāo)回收率結(jié)果見表4，可以看出11種化合物在本文試驗條件下回收率良好，均接近100%，RSD%在0.6%～1.3%。

以信噪比為3計算檢出限，結(jié)果為：那紅地那非0.1 μg/mL，紅地那非0.1 μg/mL，伐地那非0.1 μg/mL，羥基豪莫西地那非0.15 μg/mL，西地那非0.1 μg/mL，豪莫西地那非0.1 μg/mL，氨基他達(dá)拉非0.05 μg/mL，他達(dá)拉非0.05 μg/mL，硫代艾地那非0.05 μg/mL，偽伐地那非0.05 μg/mL，那莫西地那非0.05 μg/mL。由以上試驗結(jié)果可以看出，采用本文中優(yōu)化的方法可完全滿足定性、定量的要求。

表3 各對照品線性方程Table 3 Linear equation of reference substance

表4 各組分加標(biāo)回收率Table 4 Standard addition recovery of reference substance

表5 11種藥物化合物質(zhì)譜條件Table 5 Mass spectrometry conditions of 11 kinds of compounds

圖2 11種化合物的MS圖譜Fig.2 The MS figure of 11 kinds of compounds

3.2 液質(zhì)連用法測定結(jié)果

通過對各物質(zhì)單標(biāo)對照品的測定,優(yōu)化出最適質(zhì)譜條件，結(jié)果見表5，采用表5的質(zhì)譜條件對11藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，得到11種藥物的全掃描圖及相應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)譜圖，結(jié)果見圖2a，產(chǎn)生的特征子離子與文獻(xiàn)資料一致[5]。 通過MRM的譜圖（圖2b）還可以看出，11種藥物化合物分離度良好，基線噪音較小，通過與單標(biāo)進(jìn)行比對，其準(zhǔn)確度高，由此可以看出該法分離效果好,準(zhǔn)確度高,能同時進(jìn)行11種藥物測定。

通過本文建立的MRM方法對3批補腎膠囊進(jìn)行檢測，未檢測出與11種化藥成分相同的離子對，表明該補腎膠囊未非法添加此11種化學(xué)藥品。

4 討 論

采用國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗補充方案中的檢驗方法，11種化合物出現(xiàn)了峰形拖尾、分離度不好等情況。所以本文對其進(jìn)行了優(yōu)化。采用流動相代替甲醇對混合對照品進(jìn)行稀釋，調(diào)整梯度洗脫時間。通過對11種化合物單標(biāo)進(jìn)行母離子、子離子掃描得到最適質(zhì)譜條件，且本法分離度好，質(zhì)譜響應(yīng)及準(zhǔn)確性較高，符合定性定量的要求。

MRM方式是通過檢測設(shè)定好的某類藥物的特征離子對的方式來進(jìn)行定性及定量檢測的，與常規(guī)一級質(zhì)譜相比，該法特異性高，受樣品中其他物質(zhì)的干擾小，能快速準(zhǔn)確的篩查特定物質(zhì)的存在與否，適用于保健食品中非法添加化藥的監(jiān)測檢驗工作。

［1］ 邢俊波,曹紅,張炯,等.高效液相色譜法同時測定補腎壯陽類中成藥及保健食品中非法添加7種化藥成分[J].時珍國醫(yī)國藥,2014,25(2):451-453 .

［2］ 張建麗,王小兵.LC/MS和LC-MS/MS定性檢測保健食品中非法添加的伐地那非[J].質(zhì)譜學(xué)報,2009,30(4):219-222.

［3］ 張翠英,李振國,徐金玲,等.UPLC/MS/MS法檢測補腎壯陽類中成藥中非法添加枸櫞酸西地那非的定性定量研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2007,17(10):1741-1742.

［4］ 高詠麗,鄔曉鷗,肖麗和,等.HPLC-MS_MS法測定補腎壯陽類藥品或保健品中非法添加羥基豪莫西地那非的研究[J].中成藥,2009,31(7):1058-1061.

［5］ 李航,陳小泉,杜鋼,等.保健食品中11種西地那非類藥物的檢測[J].生命科學(xué)儀器,2014,12(6):39-44.

工程塑料代替金屬或?qū)⒊蔀槲磥碲厔?/p>

在各種塑料中，有的像石頭一樣堅硬，有的像鋼一樣堅韌，有的鋼黃金一樣安定。也有人認(rèn)為，用工程塑料代替金屬，產(chǎn)品質(zhì)量要降低。事實是，用工程塑料代替金屬在許多場合卻提高了產(chǎn)品的質(zhì)量。下面將工程塑料與金屬進(jìn)行比較，以使大家對工程塑料的性能有比較正確全面的認(rèn)識。

工程塑料和金屬相比，主要的優(yōu)點有：

(1)制品質(zhì)量輕：工程塑料的比重一般在0.83～2.2左右，只有鋼鐵的1/9～1/4，鋁的1/2左右。有些工程塑料，例如聚丙烯等，比水還輕得多。塑料的這一特性，對要求減輕自重的機械裝備，如車輛、船舶和飛機等，具有特別重要的意義。

(2)比強度高：對于等體積的材料來說，工程塑料的強度一般比金屬要低些，然而由于工程塑料比金屬要輕得多，因此以等重量相比時，則有些工程塑料的強度比一般金屬高得多，是現(xiàn)有結(jié)構(gòu)材料中強度最高的材料。例如，玻璃纖維增強的環(huán)氧樹脂，它的單位重量的抗拉強度比一般鋼材要高2倍左右。

(3)化學(xué)穩(wěn)定性好：工程塑料一般對酸、堿等化學(xué)藥品，均有良好的抗腐蝕能力，這是一個很顯著的優(yōu)點。其中聚四氟乙烯和聚氯醚具有非常突出的抗腐蝕能力，在用于化工防腐設(shè)備等方面有著廣闊的發(fā)展前途。

Simultaneous Determination of 11 Kinds of Compositions Illegally Added in kidney healthy food by HPLC-MS/MS

ZHU Jie，HE Wei，MA Gui-juan
（Ningxia Food Testing Center, Ningxia Yinchuan 750004，China）

A method was established to determine 11 kinds of compositions illegally added in kidney healthy food by HPLC-MS/MS. HPLC was used to investigate the linear relationship, precision, stability and recovery rate. Scan, sim and product ion methods were used to optimize the MS parameters. The results show that the linear relationship, precision and stability are good（r≥0.999 9. The recovery rate of each group is 96.8%～100.5%. The separation of each group is good, and the MRM is accurate and fast. The method is suitable for qualitative and quantitative determination and rapid screening of the 11 kinds of compositions in kidney healthy food.

Healthy food; Illegally added; MRM; Rapid screening

O 657

： A

： 1671-0460（2015）11-2729-04

2015-09-02

朱捷（1988-），男，浙江湖州人，初級職稱，碩士研究生，2013年畢業(yè)于西南科技大學(xué)植物學(xué)專業(yè)，從事食品檢測工作。E-mail：zhujie_258@126.com。