miR-487a在腎透明細胞癌中的表達及臨床意義

劉有黃，徐　鋒，張征宇，葛京平，高建平，程　文

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院泌尿外科，南京 210002)

miR-487a在腎透明細胞癌中的表達及臨床意義

劉有黃，徐鋒，張征宇，葛京平，高建平，程文※

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院泌尿外科，南京 210002)

摘要：目的探討miRNA-487a在腎透明細胞癌(ccRCC)中的表達及臨床意義。方法收集2011年1月至2012年12月在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院泌尿外科手術切除的45例配對ccRCC組織及癌旁正常腎組織，常規(guī)提取45例新鮮ccRCC與癌旁組織中總RNA，應用熒光定量反轉錄-聚合酶鏈反應法檢測標本中miRNA-487a的表達狀況；分析miRNA-487a表達差異與臨床病理特征間的關系。結果與癌旁組織(1.00)比較，miRNA-487a在ccRCC表達水平為(3.30±1.03)，明顯上調 (P<0.05) 。miRNA-487a的表達在不同腫瘤浸潤程度及Fuhrman分級間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而與年齡、局部淋巴結轉移和遠處轉移均無關(P>0.05)。結論miRNA-487a在腎透明細胞中表達上調，可能為促進ccRCC的發(fā)生、發(fā)展的因素之一。

關鍵詞：腎透明細胞癌；微RNA-487a；微RNA

腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是成年人中最常見的一種腎臟惡性腫瘤[1-2]，對化療、放療均不敏感，其發(fā)生、發(fā)展的分子機制至今仍不清楚，目前尚無明確的臨床應用腫瘤標志物。研究證明，微RNA(microRNA，miRNA)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[3]。研究顯示，miRNA可能會成為一種潛在ccRCC的早期診斷、判斷預后和靶向治療的新途徑[4-5]。迄今為止，miRNA在ccRCC中的功能研究較少，提示這一領域的研究仍處在早期探索階段，有繼續(xù)深入探索的巨大空間。本研究應用基因芯片技術檢測ccRCC及癌旁組織中miRNA-487a表達，探討其與ccRCC發(fā)生的關系，以期為闡明ccRCC發(fā)生的分子機制提供新的依據。

1資料與方法

1.1一般資料收集2011年1月至2012年12月在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院泌尿外科手術切除的45例配對ccRCC組織及癌旁正常腎組織，所有病例均行腎癌根治術。患者男33例、女12例，年齡36～72歲，平均(47±5)歲；其中行根治性腎切除患者39例,腎部分切除術患者6例；按照世界衛(wèi)生組織分類標準進行病理診斷:ccRCC 38例,腎乳頭狀細胞癌2例,腎嫌色細胞癌3例,其他類型2例；按照美國癌癥聯(lián)合會的TNM分期標準進行分期：其中T1期25例,T2期8例,T3期7例,T4期5例,N0期40例,N1期5例,M0期41例,M1期4例；按照Fuhrman Grade分級為1級12例,2級18例,3級9例,4級6例。

1.2方法取材后沖去污物，轉存液氮中備用

1.2.1總RNA抽提及質量檢測應用Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)，按說明書要求提取總RNA。使用Nanodrop ND-1000測定RNA濃度并評估純度，采用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.2.2miRNA芯片雜交采用miRCURYTMArray Power標記試劑盒(上海康成生物有限公司實驗室提供)，按照說明書進行芯片雜交。雜交后取出芯片，用miRCURYTM Array清洗緩沖試劑盒洗片，芯片干燥后立即使用GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片，芯片圖像的原始熒光強度數(shù)據由GenePix pro V6.0完成分析。

1.2.3熒光定量反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測miRNA-487a表達miRNA-487a及內參U6均按以下程序進行擴增：95 ℃，3 min；40個PCR循環(huán)(95 ℃，15 s；60℃，20 s；72 ℃，20 s；78 ℃，20 s(收集熒光)。為了建立PCR產物的熔解曲線，擴增反應結束后，按以下程序進行：95 ℃，2 min；60 ℃，20 s；72 ℃，20 s；99 ℃，15 s，并從72 ℃緩慢加熱到99 ℃(8 min)。相應的PCR引物如下：U6正義鏈：5′GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3′，反義鏈：5′CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3′，長度 89 bp；miRNA-487a正義鏈：5′GGGAATCATACAGGGACAT3′，反義 鏈： 5′TGCGTGTCGTGGAGTC 3′，長度62 bp。兩者均按以下程序進行擴增：95 ℃，3 min；40個PCR循環(huán)[95 ℃，15 s；60 ℃，20 s；72 ℃，20 s；78 ℃，20 s(收集熒光)]。

1.2.4PCR產物的定量校正和判定分析通過Light Cycler軟件獲得miRNA-487a的循環(huán)閾值(Ct值)，計算ΔCt值，ΔCt=miR-487a Ct值-U6 Ct值，以2 -ΔΔ Ct表示miR-487a的相對表達水平，按目的基因表達量=2-ΔΔ Ct公式計算各樣本miRNA-487a的含量。

2結果

2.1RNA質量鑒定變性瓊脂糖凝膠電泳后能觀察到28 s、18 s、 5.8 s(5 s),提示所提取的RNA完整可用于后續(xù)實驗。分光光度法提示A260/A280的值為1.90～2.0，A260/A230的值為1.89～2.28。

2.2RT-PCR驗證結果miRNAs定量RT-PCR擴增曲線和溶解曲線，顯示溶解曲線呈單峰引物，引物的特異性較好。見圖1、圖2。

2.3miRNA-487a在ccRCC中的表達及與腎癌臨床病理特征的關系miRNA-487a在ccRCC和癌旁組織中的表達水平分別為(3.30±1.03)和1.00，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。miRNA-487a的表達與年齡、局部淋巴結轉移和遠處轉移均無關(P>0.05)。miRNA-487a下調在T2~4期多于T1期、Fuhrman 分級3~4級多于1~2級(P<0.05)。見表1。

3討論

miRNAs是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內源性的具有調控功能的小分子非編碼RNA，其大小長為20～25個核苷酸，miRNA與其靶mRNA的3′非編碼區(qū)特異性結合而介導翻譯水平的調控，調節(jié)了細胞生長、組織分化等一系列生命過程[6-7]。已有研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs可充當癌基因、抑癌基因的角色，其表達與肺癌、胰腺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、結直腸癌、肝癌等多種癌癥相關[8]。miRNAs參與腫瘤發(fā)生和進展，可作為腫瘤診斷、預后的指標及腫瘤治療新的靶點。miRNA具有高度保守性、時序性和組織特異性，這種特異性表達在臨床上將有助于對特定腫瘤的診斷、治療及預后進行評估。miR-487a定位于14號染色體，在乳腺癌中表達上調，在喉鱗狀細胞癌中下調[9]，而其在ccRCC惡性轉化中的作用機制目前國內外報道少見。

本研究結果顯示，miRNA-487a在ccRCC中高表達，提示miRNA-487a可能通過下調某抑癌基因的表達使正常的抑癌機制改變，從而導致腎細胞癌的發(fā)生。miR-487a在ccRCC組織中表達上調的機制目前較少見報道，但如DNA甲基化、組蛋白修飾失調等表觀遺傳學改變與ccRCC的發(fā)生和發(fā)展有

密切關系。池澤湃等[10]發(fā)現(xiàn)，miRNA-21在腎細胞癌組織中顯著高表達，其可能在腎細胞癌的早期診斷、治療、判斷預后等方面具有重要意義。Shinmei等[11]提出，miRNA-155在ccRCC組織中低表達，可作為腎細胞癌預后標志物。Doberstein等[12]發(fā)現(xiàn)，在腎癌中miRNA-145表達下調，引起整合素-金屬蛋白酶17的上調，從而導致腎癌的發(fā)生。miR-126在乳腺癌、腎癌組織中表達下調，可抑制乳腺癌的轉移[13-14]。本研究結果亦顯示，miR-487a在腎癌組織中的高表達與腎癌患者原發(fā)腫瘤的分期、Fuhrman分級差異有統(tǒng)計學意義，有助于臨床選擇治療方案和估計預后。

本研究應用基因芯片技術檢測ccRCC及癌旁組織中miRNA-487a表達，結果顯示miRNA-487a在ccRCC中高表達，并經定量RT-PCR驗證證實，微陣列基因芯片的檢測結果準確可靠，提示miR-487a在腎癌組織中高表達，可能為促進ccRCC的發(fā)生、發(fā)展的因素之一。目前miRNA-487a調控腫瘤細胞的發(fā)病機制尚未明確，有待在后續(xù)實驗中進一步研究。

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更正說明：

《醫(yī)學綜述》2015年第17期第3256頁“ⅢA期肺癌胸腔鏡輔助小切口治療后的療效及生存分析”一文中的作者“李占新”更正為“李占欣”。2015年第23期第4356頁“電視胸腔鏡下肺癌切除后患者預后影響因素分析”一文中的作者“李占新”更正為“李占欣”。

The Expression and Clinical Significance of miRNA-487a in Clear Cell Renal Cell CarcinomaLIUYou-huang,XUFeng，ZHANGZheng-yu，GEJing-ping，GAOJian-ping，CHENGWen.(DepartmentofUrology,NanjingGeneralHospitalofPLANanjingMilitaryCommand，Nanjing210002，China)

Abstract：ObjectiveTo detect the expression and clinical significance of miRNA-487a in clear cell renal cell carcinoma(ccRCC).MethodsccRCC and corresponding adjacent tissues of 45 patients admitted to the Department of Urology,Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command from Jan.2011 to Dec.2012 were collected and the total RNA was extracted routinely.The miRNA-487a expression was detected by using fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction.The correlations of miRNA-487a expression with the clinicopathologic characteristics was analyzed.ResultsThe miRNA-487a expression level of ccRCC tissue was (3.30±1.03),which was significantly higher than the adjacent tissue(P<0.05).The expression of miRNA-487a had statistically significant difference between different invasion degrees and Fuhrman gradings(P<0.05),but showed no significant correlations with the patients′age,histological type of the tumor,lymph node metastasis and distal metastasis(P>0.05).ConclusionThe up-regulated expression level of miRNA-487a in ccRCC is correlated with invasion degree and Fuhrman grading,and it may participate in the pathogenesis and development of ccRCC.

Key words：Clear cell renal cell carcinoma; miRNA-487a; MicroRNA

收稿日期：2014-11-10修回日期：2015-05-25編輯：伊姍

基金項目：南京軍區(qū)南京總醫(yī)院院內課題(2012034)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.042

中圖分類號：R737.14

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)24-4536-03