長鏈非編碼RNA在干細胞中的研究進展

蔡　慧，王　琪，葉小娟(綜述)，高　勇※(審校)

(1.同濟大學附屬東方醫院腫瘤科，上海 200120； 2.同濟大學附屬上海市肺科醫院肺癌免疫實驗室，上海 200433)

長鏈非編碼RNA在干細胞中的研究進展

蔡慧1△，王琪2，葉小娟1(綜述)，高勇1※(審校)

(1.同濟大學附屬東方醫院腫瘤科，上海 200120； 2.同濟大學附屬上海市肺科醫院肺癌免疫實驗室，上海 200433)

摘要：長鏈非編碼RNA(LncRNAs)是一類長度大于200個核苷酸且不具有蛋白質編碼功能的轉錄產物。早先，LncRNAs被認為不具有生物學功能，只是轉錄過程中的副產物。近年來，隨著對LncRNAs 研究的不斷深入，人們的觀念正在發生改變。現已發現，LncRNAs參與細胞生長、分化、增殖、凋亡等多項生命活動，且與人類多種疾病密切相關。近年來有關LncRNAs與干細胞的研究正在引起人們的關注，這些研究提示LncRNAs參與多種干細胞自我更新和分化的調控。

關鍵詞：長鏈非編碼RNAs；干細胞；自我更新；分化；腫瘤

隨著人類基因組計劃的不斷推進，人們發現90%以上的基因組DNA能轉錄成RNA，而其中不足2%編碼蛋白質[1-2]，其余不能編碼蛋白質的轉錄產物被稱為非編碼RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)[3]。根據長度不同，ncRNAs可以分為短鏈ncRNAs和長鏈ncRNAs(long ncRNAs,LncRNAs)。LncRNAs 缺乏特異完整的開放閱讀框，幾乎不具有蛋白編碼功能。近年來有研究報道LncRNA參與干細胞多種生物學特性的調控[4]。現將對LncRNAs在干細胞中的研究進展予以綜述，重點剖析LncRNAs與干細胞自我更新和多向分化之間的關聯。

1LncRNAs的概念

LncRNAs是一類長度通常大于200個核苷酸，缺少特異完整的開放閱讀框，不具有或幾乎不具有蛋白質編碼功能的RNA，在總ncRNAs中占有相當大的比例。LncRNA起初被認為是基因組轉錄的“噪音”，因其數量、種類、功能狀況均不明確，且尚缺乏有效的研究手段，故又被稱作基因組中的“暗物質”[5]。盡管這些RNA不能編碼蛋白質，卻能在基因表達的多個環節(包括表觀遺傳、轉錄調控以及轉錄后調控等)發揮調控作用。

2LncRNAs的結構、分類和功能

LncRNAs與mRNA相似，經過剪切，具有多聚腺苷酸(polyA)尾和啟動子結構。LncRNAs具有較低的進化保守性，其在細胞中的表達水平也明顯低于編碼蛋白的RNAs。大約2/3的LncRNAs來源于基因之間的廣大基因組區域，其余的則來源于與編碼蛋白的基因重疊、反義或基因內區域。根據與編碼蛋白基因的位置關系，LncRNAs大致分為正義(sense)、反義(antisense)、雙向(bidirectional)、基因內(intronic)和基因間(intergenic)5種類型[6]。通過在不同組織和細胞中進行高通量的RNA測序實驗發現LncRNAs的表達還具有明顯的組織和細胞特異性[7-13]。近年來大量研究表明，LncRNAs 與許多細胞學功能有著密切的聯系[14-17]。如LncRNA 可以作為短鏈ncRNAs的前體，形成微RNA以及內源小干擾RNA，還可以作為微RNA“分子海綿”，對有活性的微RNA產生長效的抑制作用[15]；在細胞亞結構以及蛋白復合物的形成過程中LncRNA發揮“腳手架”的作用[16]，可以將兩個或兩個以上的蛋白分子“綁和”形成復合物。簡言之，LncRNAs可以通過與ncRNAs，mRNA，基因組DNA以及多種蛋白質相互作用在轉錄、轉錄后、翻譯水平以及表觀遺傳等多個層面影響細胞的生命活動。

3LncRNAs與干細胞

干細胞是一類能夠自我更新并具有多向分化潛能的細胞。在一定條件下，它們能夠分化成多種成熟的功能細胞。近年來關于LncRNAs在干細胞中的研究層出不窮。

3.1LncRNA與胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs) ESCs通常是由早期胚胎內細胞團(如桑葚胚，囊胚)或原始生殖細胞經體外分化抑制培養篩選出的一類多能干細胞，在體外具有無限增殖、自我更新和多向分化的能力。最近研究已經證實LncRNAs在維持人類ESCs自我更新能力和多能性方面具有重要作用[17]。

Guttman等[14]最先對基因間的長鏈ncRNAs(large intergenic non-coding RNA，LincRNAs)在ESCs中的表達和功能做了一系列研究，RNA測序結果顯示有226條LincRNAs在鼠ESCs中顯著高表達。他們發現絕大多數的LincRNA(約93%)對ESCs中的基因表達有明顯的調控作用，有26條LincRNAs 能夠顯著影響多能性調控因子Nanog的表達水平，表明LincRNAs在維持干細胞多能性以及抑制細胞分化中起到重要作用。他們還發現，有13條LincRNAs與ESCs內胚層的分化有關，7條與外胚層的分化有關，5條與神經外胚層分化相關，7條與中胚層的分化相關，2條與滋養外胚層的分化相關。這說明LincRNA在ESCs的種系特異性分化中發揮重要的調控作用。隨后他們還研究了ESCs中的LincRNA是否受到多能性相關轉錄因子(Oct4,Sox2,Nanog,cMyc,nMyc,KLF4,ZFX,Smad and TCF30)的調控。結果發現有75%的LincRNA的啟動子區域能與至少一條多能性轉錄因子相結合，說明這些LincRNAs是多能性相關轉錄因子的作用靶點。此外還發現有74條(30%)的LincRNAs與ESCs中重要的染色質修飾蛋白密切相關。

Dinger等[18]在鼠ESCs中發現了12條LncRNAs與轉錄因子Pou5f1、Nanog、Sox2的表達譜相似，這些轉錄因子在維持ESCs多能性狀態中具有重要作用。隨后運用染色質免疫沉淀(ChIP)以及抗-Pou5f1和抗-Nanog抗體進一步證實了這些LncRNAs確實與Pou5f1和Nanog相結合[19]。

Ng等[20]也發現了36條LncRNAs的表達譜與Oct4和Nanog相似，而Oct4和Nanog在ESCs中普遍高表達且在分化成熟的細胞中表達降低。LncRNAs表達譜芯片結果顯示，在人類ESCs和神經前體細胞中有934條LncRNAs的表達有明顯差異，其中有36條LncRNAs在神經前體細胞中顯著下調。隨后他們挑選了3條LncRNAs(ES1，ES2，ES3)做進一步的功能性研究，發現這3條LncRNA中任意一條被沉默以后，均會促使ESCs分化。RNA免疫沉淀實驗發現，在細胞核內ES1和ES2與多梳基因家族成員SUZ12以及多能性調控因子SOX2密切相關。

Sheik Mohamed等[21]通過免疫沉淀反應，找到了一組與Oct4和Nanog結合的LncRNAs，并對這些RNAs做了后續的測序實驗，隨后干擾了這些LncRNAs的表達并觀察了ESCs分化活動的變化，結果提示，有部分與Oct4和Nanog結合的LncRNAs具有調控Oct4和Nanog的作用。

這些研究表明，ESCs的多能性以及種系特異性分化受到LncRNA作用網絡的嚴密調控，而這些LncRNAs中又有很大一部分受到ESCs內眾多轉錄因子的調控。

3.2LncRNAs與誘導多能干細胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs) 已經分化成熟的體細胞(如纖維母細胞、卵母細胞等)可以在OCT4、SOX2、 KLF4 (OSK)、c-myc等轉錄因子的誘導下，通過重編碼形成與ESCs及其類似的一類多能干細胞，稱為iPSCs[22-23]。這類干細胞具有多向分化的能力，可以分化成幾乎所有的細胞類型。近年來關于iPSCs與LncRNAs 的研究也受到人們的廣泛關注。

在絕大多數iPSCs中，LncRNA-Gtl2的表達常被抑制，Gtl2基因呈母系表達，且能抑制父系基因Dlk1的表達，后者與Gtl2處于同一個基因簇(Dlk1-Dio3)并參與胎兒生長的調控[24]。此外，定位于Dlk1-Dio3基因簇中的26條miRNAs在非四倍體互補態和四倍體互補態的iPSCs中也呈差異表達。iPSCs中Dlk1-Dio3基因簇的沉默可直接導致這些iPSCs的發育受到阻滯。

Loewer等[25]對iPSCs中LncRNAs的表達與ESCs進行了比較，發現 28條lncRNAs對生成iPSCs有選擇性優勢。隨后他們又從中篩選出3條可以與多能性轉錄因子(Nanog,Oct4,Sox2)結合的LncRNAs(lncRNA-SFMBT2,lncRNAVLDLR和lncRNA-ROR)。lncRNA-ROR在iPSCs中顯著高表達，并受到多能性轉錄因子(OCT4,SOX2和NANOG)的直接調控。進一步的研究顯示，ROR被下調以后，可以明顯抑制iPSCs的成球能力，而反之則能促進iPSCs的成球能力[25]。ROR還可以抑制p53的活性，這提示ROR之所以能夠促進iPSCs的自我更新和分化，原因之一可能是它抑制了iPSCs的凋亡。

Wang等[26]對ROR的功能進行了更深入的研究，同樣發現ROR在調節干細胞多能性方面起重要調控作用。由于LncRNAs 可以作為“分子海綿”對miRNA起競爭性抑制作用從而阻斷這些miRNAs下游靶基因的功能，研究者隨后就ROR是否可以作為miRNA“海綿”從而對Oct4和Nanog進行調控進行了驗證。實驗證明ROR可以降低體內環境中miR145的表達水平，從而阻斷miR145對Oct4,Sox2和Nanog的依賴性抑制作用，促進了干細胞的分化[26]。

3.3lncRNAs與成體干細胞由于成體干細胞可以從人體各個不同的組織中分離獲得，并具有分化成多種成熟細胞系的能力，所以被人們廣泛應用于臨床研究，相比于ESCs而言，這避免了許多倫理和法律的約束。

Zuo等[27]在間充質干細胞的成骨分化的研究中發現有116條LncRNAs在分化過程中呈差異性表達。另外，Kretz等[28]在研究中發現，LncRNA-ANCR在上皮細胞分化過程中表達量有所下降，它能夠調節一系列基因的表達從而抑制上皮細胞的分化。Ramos等[29]研究表明，LncRNA-Six3os和Dix1as在神經干細胞中對膠質神經元種系特異性具有調節作用。此外，Yildirim等[30]證實了LncRNA-Xist在維持造血干細胞活性中占有不可或缺的地位。

Sun等[31]對體外培養的前脂肪細胞、棕色和白色脂肪細胞以及單個的成熟脂肪細胞進行RNA測序，結果顯示有20條 LncRNA在脂肪形成的過程中呈上調趨勢。隨后利用RNA干擾技術進行進一步的研究發現，這些LncRNAs的表達沉默可以導致幾乎所有的成熟脂肪細胞向前體脂肪細胞轉變。此外，Pang等[32]研究表明，PU.1基因的反義LncRNA可以與PU.1基因的mRNA結合形成mRNA/LncRNA二聚體抑制PU.1的翻譯，促進前脂肪細胞的分化成熟。

3.4LncRNAs與腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs) CSCs的概念最早是在19世紀60年代由Cohnheim提出的，研究者認為腫瘤的發生、發展是由于腫瘤中存在一類為數不多但具有干細胞特征的細胞[33]。近年來隨著技術水平的提高(如流式細胞分析和細胞分選技術等的廣泛應用)，以及各種動物模型的建立，CSCs的概念已經被越來越多的學者所認可并加以研究。CSCs具有干細胞的多種特征，包括自我更新和多向分化的潛能。它們可以促進腫瘤細胞的增殖、分裂，誘導腫瘤細胞的分化[34]。

最近的研究表明，在ESCs的分化中起到關鍵作用的信號通路(如OCT4,SOX2,KLF4和PcG等)在CSCs中同樣處于激活狀態[35-38]。同時有報道，OCT4、SOX2等信號通路受到LncRNAs 的調控[26]，并且LncRNAs與腫瘤的相關研究近年來受到廣泛關注。這些信息提示LncRNAs與CSCs分化也極有可能存在重要的調控關系。

研究表明，多梳基因如PcG在調節ESCs的自我更新和分化過程中起關鍵作用，而多梳基因信號通路又與多種腫瘤有密不可分的聯系[38]。有研究者推斷，LncRNA有可能通過與多梳基因復合物相互作用，抑制CSCs分化的進行[38]。

先前已有多項研究證明有部分ncRNAs尤其是miRNAs在CSCs的調節中發揮重要作用。如Han等[39]在2010年報道了miR-29a可以調控早期的造血過程，并誘導急性髓細胞白血病的發生，其中重要的機制之一就是miR-29a可以通過影響多個腫瘤抑制基因和細胞周期蛋白的活性，導致骨髓祖細胞往白血病干細胞方向轉變。Bitarte等[40]則發現miR-451可以調控CSCs的多種干細胞能力，包括自我更新，腫瘤形成以及耐藥性。在細胞成球培養中，下調miR-451可以增加巨噬細胞移動因子和多能性轉錄因子SOX2的表達，使細胞獲得自我更新和腫瘤形成的能力。巨噬細胞移動因子和SOX2同時又參與Wnt信號通路的激活，而Wnt信號通路對于結腸癌干細胞活性的維持是至關重要的[41]。這又進一步說明miR-451可以通過調控Wnt信號通路來影響干細胞活性。近期有學者提出LncRNAs在調節CSCs分化的過程中，其中可能的一個機制是作為“分子海綿”，對miRNAs產生長效的抑制作用，從而對CSCs的干細胞活性產生間接調控的作用。如Kallen等[42]最近的研究發現LncRNA-H19就可以作為Let-7 家族的miRNAs的“分子海綿”從而影響Let-7的多種生物學功能。而此前Yu等[43]已經證實Let-7是乳腺癌干細胞中重要的調控因子，分別通過影響RAS和高遷移率族蛋白A2來調控干細胞的自我更新和分化的能力。科學家們期待有更多的研究能夠針對LncRNA作為“分子海綿”影響CSCs活性方面提供更多更有力的證據。

4結語

近年來，LncRNAs對干細胞的調控作用引起人們廣泛關注[17]。LncRNAs對干細胞的自我更新及分化能力確有明顯的調控作用。然而，現有研究絕大部分局限于分子水平，尚缺乏可靠的體內試驗為這些結論提供更加強有力的支持。今后的研究除了要對LncRNAs在干細胞中的作用機制做更深入的探討，動物體內實驗也同樣重要，這將為人們提供更強有利的證據以揭示LncRNAs在人類多種疾病中發揮的功能，使LncRNAs有望成為人們診斷疾病的重要分子標志物，并為疾病的治療提供新的手段。

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Research Advances of Long-non Coding RNAs in Stem CellsCAIHui1,WANGQi2,YEXiao-juan1,GAOYong1. (1.DepartmentofOncology,EastHospital,TongjiUniversity,Shanghai200120,China; 2.DepartmentofLungCancerandImmunology,ShanghaiPulmonaryHospital,TongjiUniversity,Shanghai200433,China)

Abstract:Long non-coding RNAs(LncRNAs) are a sort of non-protein-coding transcriptional products that are composed of more than 200 nucleotides.In the past,LncRNAs were thought as non-functional by-products of transcription,however,the notion is changing with increasing studies for LncRNAs function.It has been shown that LncRNAs are involved in the regulation of cell growth,differentiation,proliferation and apopatosis,and are associated with multiple human diseases.Recently，studies concerning LncRNAs and stem cells are attracting people′s attention,the results indicated that LncRNAs are involved in self-renew and differentiation of various stem cells.

Key words：Long non-coding RNAs; Stem cells; Self-renewal; Differentiation; Tumor

收稿日期：2015-03-24修回日期：2015-06-01編輯：相丹峰

基金項目：上海市醫學重點專科建設(ZK2012A26);浦東新區衛生系統重點學科群建設(PWZxq2014-04);上海市浦東新區衛生系統領先人才培養計劃(PWRL2013-02)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.005

中圖分類號：R394

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)24-4429-04