結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性所致的基因耐藥與表型耐藥不一致的研究進展

張麗霞(綜述)，邵世峰(審校)

(國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥防治傳染病重點實驗室 天津市海河醫(yī)院檢驗科，天津 300350)

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結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性所致的基因耐藥與表型耐藥不一致的研究進展

張麗霞(綜述)，邵世峰※(審校)

(國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥防治傳染病重點實驗室 天津市海河醫(yī)院檢驗科，天津 300350)

摘要：結(jié)核病治療和防治是全球性公共衛(wèi)生問題，治療中抗結(jié)核藥物的不規(guī)范使用,加上患者的依從性差，造成了結(jié)核菌耐藥率不斷增高，成為目前治療上的難題之一。結(jié)核菌耐藥有多種原因，其中異質(zhì)性是結(jié)核菌耐藥的一個微小變化過程。臨床檢驗中由于常規(guī)方法的局限性無法檢測頻率過低的菌株而造成耐藥結(jié)果的偏差，出現(xiàn)了同一標本不同方法藥敏試驗結(jié)果不一致的現(xiàn)象，提示結(jié)核分枝桿菌的異質(zhì)性對藥敏結(jié)果有影響。

關鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；異質(zhì)性耐藥；表型耐藥；基因耐藥

當前，耐藥性問題是結(jié)核病最重要的問題之一,特別是耐多藥結(jié)核病、嚴重耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)給結(jié)核病的治療帶來了更大的困難[1]。世界衛(wèi)生組織估計約2/3的結(jié)核病患者處于耐多藥的危險之中[2]。所以，藥敏試驗的正確判斷和耐藥監(jiān)測對結(jié)核病控制和流行病學統(tǒng)計起著重要作用。因此，研究結(jié)核菌耐藥機制，掌握各種檢測方法的特性，快速、準確地給臨床提供治療依據(jù)是每個實驗室工作者追尋的目標。傳統(tǒng)的結(jié)核菌檢測方法具有金典性，但隨著基因檢測技術的發(fā)展，結(jié)核菌快速鑒定和藥敏試驗為患者治療提供了更為有利的條件。目前結(jié)核耐藥基因技術已走向臨床，對結(jié)核患者進行快速篩查和藥敏分析已成為必然趨勢，現(xiàn)就基因耐藥和表型耐藥結(jié)果不一致現(xiàn)象予以綜述。

1結(jié)核分枝桿菌基因的研究

傳統(tǒng)的結(jié)核菌基因分型技術以核酸為主，從表型特征上認識細菌，主要有噬菌體分型、血清分型、藥物敏感試驗分型、細胞蛋白電泳、生物化學多樣性分析等。隨著科技的進步和方法學的變化，目前多采用限制性片段長度多態(tài)性、間隔區(qū)寡核苷酸分型技術、可變串聯(lián)重復序列技術、單核苷酸多態(tài)性分析、長片段多態(tài)性等來分析。限制性片段長度多態(tài)性方法具有較高的分辨率和菌株鑒別的能力；間隔區(qū)寡核苷酸分型技術是基于染色體上直接重復區(qū)位點的多態(tài)性，方法簡便、重復性高、只需少量DNA，被公認為北京家族菌株鑒定的金標準[3]；可變串聯(lián)重復序列技術被美國疾病預防中心推薦為結(jié)核分枝桿菌基因分型的首選方法，其操作簡便、快速、成本低，以聚合酶鏈反應為基礎，也被稱為可變串聯(lián)重復序列技術[4]。目前采用的線性探針檢測技術可檢測出結(jié)核分枝桿菌的rpoB、katG、inhA、ahpC、kasA、ndh、OxyR-ahpC、mabA-inhA、furA-katG、fabG-inhA以及編碼外排泵蛋白質(zhì)的efpA、iniA、iniB、 iniC基因等[5]。近年來，隨著分子生物學技術日趨成熟，對結(jié)核分枝桿菌的基因及耐藥機制進行了更加深入的研究，定位了結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的位置、基因突變位點和藥物的關系來判斷耐藥性，使人們對結(jié)核病的流行特點和傳播有了更深刻的理解和掌控。

2耐藥的概念、機制與檢測方法

2.1耐藥的概念及機制結(jié)核病分為直接感染耐藥結(jié)核菌引起的原發(fā)耐藥和結(jié)核分枝桿菌菌株基因組發(fā)生突變而產(chǎn)生的獲得性耐藥[6]。原發(fā)性耐藥指從未因結(jié)核病而被治療過的患者，或曾因結(jié)核病被治療過但少于1個月的患者，他們帶有一種或多種抗結(jié)核藥物耐藥結(jié)核分枝桿菌；而獲得性耐藥是指結(jié)核患者開始接受抗結(jié)核藥物治療后，在治療過程中結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生一種或多種抗結(jié)核藥物的耐藥性[7]。目前結(jié)核桿菌發(fā)生耐藥的機制可從細胞水平與分子水平來分析，細胞水平的耐藥機制與結(jié)核桿菌對抗結(jié)核藥物的耐藥概率、療效、病灶中細菌數(shù)量及藥物種類的應用有直接的關系，病灶中結(jié)核桿菌數(shù)量越大，突變概率越大，耐藥的機會也越多[8]。單一用藥耐藥的概率大于聯(lián)合用藥，用藥數(shù)量越多、耐藥的機會越少，耐多藥結(jié)核病的發(fā)生率也越低[9]；分子水平上的耐藥機制與細胞膜通透性、產(chǎn)生降解或滅活酶類、藥物的作用靶位相關[10]。另外，染色體突變介導的藥物靶編碼基因的各種突變基因，是結(jié)核分枝桿菌耐藥的主要分子機制[11]。

2.2檢測方法目前我國檢測結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗的方法主要有傳統(tǒng)的固體檢測法(包括比例法、絕對濃度法和耐藥性法)和現(xiàn)代的快速培養(yǎng)儀系統(tǒng)(常用的有全自動分枝桿菌檢測儀、全自動血培養(yǎng)儀及顯微鏡觀察藥物敏感性檢測)[12]；近代的線性探針技術、基因芯片測序等技術也逐步應用于結(jié)核病快速診斷和耐藥基因突變的臨床檢測中[13]。各種方法都有各自的敏感性和特異性，由于操作者不同而存在較大差異。絕對濃度法在判斷上未對“敏感”和“耐藥”下明確定義，僅記錄培養(yǎng)基上菌落生長的豐度來報告，結(jié)果不直觀，人為因素多，給藥敏試驗室間質(zhì)控帶了困難；相比之下，比例法對藥物敏感試驗中接種量進行了校準，它采用了兩種菌液濃度(10-2mg/mL和10-4mg/mL)，通過計算活性單位的比值獲得，使結(jié)果更加精準，定義1%為“敏感”和“耐藥”的臨界點[14]。全自動分枝桿菌檢測/藥敏系統(tǒng)是目前常用的液體快速檢測方法，該方法在分枝桿菌生長指示管底部包埋熒光感應器，對培養(yǎng)基內(nèi)溶解的氧氣敏感，加入標本孵育后若無細菌生長培養(yǎng)基內(nèi)大量的氧氣抑制熒光感應器發(fā)出熒光，儀器檢測為陰性；如有細菌生長則消耗培養(yǎng)基內(nèi)氧氣，激活熒光感應器發(fā)出熒光，儀器檢測熒光強度增強，儀器檢測為陽性，一般在標本培養(yǎng)后的4～12 d內(nèi)報告陽性結(jié)果。自動液體培養(yǎng)系統(tǒng)比傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基顯示了較好的敏感性和檢測快速的優(yōu)點[15-16]。但由于藥敏種類少不能更好地滿足臨床需求，不能有效篩查嚴重耐藥結(jié)核病菌株，所以也同時使用傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)法對二線藥及氟喹諾酮藥物的監(jiān)測，因此也就出現(xiàn)了在實際工作中遇到的同一標本，同一種藥物兩種方法藥敏結(jié)果判斷不一致的現(xiàn)象。對此，O′Grady等[17]報道，通過不同藥敏測試方法在檢測時間、準確性、實用性、菌液濃度等方面的比較得出，結(jié)果不符的原因可能與菌株低水平的耐藥有關，也可能是因為該菌落中耐藥和敏感的亞群比例不同。宿主的多態(tài)性、結(jié)核菌敏感和耐藥的數(shù)量或菌種的異質(zhì)性是造成細菌是否耐藥的主要原因[18-19]。

3結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性耐藥的產(chǎn)生

異質(zhì)性耐藥是指在同一標本中同時存在敏感菌和耐藥菌的現(xiàn)象，這體現(xiàn)了細菌群體從部分耐藥向完全耐藥的微小轉(zhuǎn)變過程。臨床標本中存在同一患者相同時間分離的標本液體法和固體法藥敏結(jié)果不一致的現(xiàn)象，究其原因是實驗室污染、多重感染、異質(zhì)性耐藥、檢測方法問題或是細菌本身對藥物敏感性不均一問題，這些問題的存在對結(jié)核病的耐藥性診斷及治療提出了挑戰(zhàn)。目前國內(nèi)外對同一患者同次送痰的兩種方法藥敏結(jié)果不一致的菌株進行分析的文獻還較少，有學者報道用高通量測序技術研究了結(jié)核患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性耐藥的發(fā)展過程，發(fā)現(xiàn)在異煙肼耐藥性產(chǎn)生的早期同一細菌菌體中同時存在4～5種與異煙肼耐藥相關的突變，證明了異質(zhì)性耐藥的真實存在[20-21]。

4研究異質(zhì)性耐藥結(jié)核分枝桿菌的臨床意義

異質(zhì)性耐藥是從敏感菌向耐藥菌轉(zhuǎn)變的過程，研究異質(zhì)性耐藥能加深對耐藥結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展過程的認識，異質(zhì)性耐藥標志著細菌突變數(shù)量的多少和用藥劑量的大小。在進行耐藥性評價時，不僅要考慮到方法學的差異，還應考慮是否存在多重感染、繼發(fā)感染及混合感染等。因此，臨床上在進行藥物敏感性監(jiān)測時要選擇靈敏性高的診斷方法，對耐藥菌特別是適應性高的耐藥菌篩查要注意方法的敏感性，盡早采用先進的基因技術預測藥物的敏感性，避免異質(zhì)性耐藥的出現(xiàn)造成結(jié)果的偏差和誤導治療方案的確立；同時，了解其耐藥程度，采取個體化用藥，真正有效控制耐藥結(jié)核病的傳播，防止和延緩結(jié)核菌向耐多藥、嚴重耐藥發(fā)展。另外，異質(zhì)性耐藥又存在于結(jié)核菌初始變化過程中，研究異質(zhì)性耐藥對評估結(jié)核病療效也具有重要意義。對結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性耐藥的認識以及是否在臨床中采取不同的治療措施[22]，在細菌群體數(shù)量較少的時候進行個體化治療，來降低耐藥細菌的產(chǎn)生，還有待大量臨床數(shù)據(jù)的支持和研究[23-25]。

5小結(jié)

比例法、絕對濃度法和全自動分枝桿菌檢測/藥敏系統(tǒng)、全自動血培養(yǎng)檢查系統(tǒng)以及顯微鏡觀察藥物法、線性探針、基因測序、結(jié)核分枝桿菌/核酸檢測等技術都在不同階段為結(jié)核病的控制和治療起著重要作用。異質(zhì)性耐藥是細菌對抗抗生素的一個效應過程，也是對治療方案的選擇、療效評價的一個驗證。研究結(jié)核菌的異質(zhì)性耐藥，必將為早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病、減緩結(jié)核菌耐藥起到積極作用。

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Research Progress of Inconsistent Results Caused by the Heterogeneity of Mycobacterium Tuberculosis Gene and Phenotypic Drug ResistanceZHANGLi-xia，SHAOShi-feng.(KeyLaboratoryofInfectiousDiseasePreventionandControlofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine，DepartmentofClinicalLaboratory,TianjinHaiheHospital，Tianjin300350，China)

Abstract：Tuberculosis(TB) treatment and prevention is a global public health problem,due to the irregular use of anti-TB drugs,plus poor compliance of the patients,TB drug resistance is increasing continuously,and has become one of the difficulties in clinical.There are many causes of TB drug resistance,and heterogenicity is a small change process,where clinical testing cannot detect low frequency drug-resistant strains because of the limitations of conventional methods,resulting in inconsistent results of the same specimen by different tests,which indicates heterogeneity influences on the drug sensitivity test.

Key words:Mycobacterium tuberculosis; Heterogeneous resistance; Phenotypic resistance; Gene resistance

收稿日期：2014-10-29修回日期：2015-01-16編輯：鄭雪

基金項目：天津市衛(wèi)生局課題(2014K2035)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.012

中圖分類號：R446.5

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)14-2526-03