劉 君，黃鳳德，胡晉太，岳明全

(四川綿陽四O四醫(yī)院，四川 綿陽 621000)

乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中p-AKT、VEGF-C的表達及其與侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系

劉 君，黃鳳德，胡晉太，岳明全

(四川綿陽四O四醫(yī)院，四川 綿陽 621000)

目的探討乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(IDC)組織磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、血管內(nèi)皮細胞生長因子-C(VEGF-C)表達水平，及其與淋巴結(jié)侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組織化學法檢測72例乳腺IDC組織及30例乳腺腺瘤組織中p-AKT、VEGF-C的表達水平，分析p-AKT與血管生成的關(guān)系。結(jié)果乳腺IDC組織中VEGF、p-AKT蛋白的陽性表達率分別為59%和67%，均顯著高于乳腺腺瘤組織中20%和17%的陽性表達率(2=13.39，21.21，P<0.05)；與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者比較，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺IDC 組織VEGF-C、p-AKT蛋白陽性表達率顯著降低(2=11.10，5.51，P<0.05)；乳腺IDC組織VEGF-C、p-AKT蛋白表達水平呈顯著正相關(guān)(r=0.823，P<0.05)。結(jié)論乳腺IDC組織中VEGF-C、p-AKT呈過度表達狀態(tài)，共同參與淋巴結(jié)的侵襲與轉(zhuǎn)移，阻斷PI3K/AKT通路有望為乳腺IDC的靶向治療提供一種新的思路。

乳腺浸潤性導(dǎo)管癌；血管內(nèi)皮細胞生長因子-C；磷酸化蛋白激酶B；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(IDC)是乳腺癌中最常見的病理類型，約占所有乳腺癌的70%。由于乳腺組織富含淋巴管網(wǎng)，早期即可出現(xiàn)淋巴道轉(zhuǎn)移，故與乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的因子成為近年來研究的重點。血管內(nèi)皮細胞生長因子-C(VEGF-C)是人類發(fā)現(xiàn)的第一種促淋巴管生成因子，參與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的調(diào)控[1]。同時研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織的PI3K/AKT通路存在異常活化[2-3]，促進血管生成、腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)作為是一種原癌基因，其與VEGF-C的異常表達對IDC侵襲、轉(zhuǎn)移的影響研究較少。本實驗采用免疫組化法檢測乳腺癌組織及乳腺腺瘤組織中p-AKT與VEGF-C蛋白的表達，旨在分析二者與乳腺IDC侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1 臨床資料

1.1一般資料 選擇2009年1月—2012年12月在我院接受手術(shù)切除的72例IDC患者的乳腺組織作為觀察組。患者均為女性，均經(jīng)手術(shù)及組織病理學確診，排除術(shù)前接受放化療及合并心肝腎等嚴重器質(zhì)性疾病者。年齡43～77(53.5±7.1)歲；美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)分期Ⅰ期15例，Ⅱ期21例，Ⅲ期31例，Ⅳ期5例；腫瘤直徑<3 cm 34例，≥3 cm 38例。選擇同期收治的30例乳腺腺瘤患者的乳腺組織作為對照組，年齡41～79(51.62±5.9)歲。2組患者基本情況比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

1.2檢測方法 采用免疫組織化學三步法，將標本組織通過10%甲醛固定、石蠟包埋， 4 μm厚連續(xù)切片后進行SP染色。每例標本組織均取相連的3張切片，常規(guī)脫蠟、水化、0.01枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)抗原熱修復(fù)。兔抗人p-AKT多克隆抗體購自美國Cell Signaling生物技術(shù)公司，兔抗人VEGF-C免疫組化多克隆抗體、兔免疫組化S-P法試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，均采用試劑盒已知陽性組織作為陽性對照，以PBS代替一抗體作為陰性對照，染色步驟按產(chǎn)品說明書進行。

1.3判定標準 VEGF-C為細胞質(zhì)著色，p-AKT為細胞核染色，均呈棕黃色或棕褐色顆粒狀分布。分別選擇5個有代表性的區(qū)域，以高倍鏡視野(×400)觀察其中10個視野，共計1 000個腫瘤細胞，采用許良中等[5]的計分方法，即無著色計為0分，淺黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分；著色的陽性細胞數(shù)百分比≤5%計為0分，6%～25%計為1分，26%～50%計為2分，≥51%計為3分。兩項積分乘積≥3分為陽性，否則為陰性。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SAS 8.2軟件包進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料比較采用2檢驗；計量資料采用表示，組間比較采用t檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1VEGF-C和p-AKT蛋白在乳腺IDC及乳腺腺瘤組織中的表達 VEGF陽性表達以細胞質(zhì)為主，而p-AKT陽性表達則以細胞核為主，尤以腫瘤組織周邊部位及壞死區(qū)域周圍細胞表達較強。乳腺IDC組織中VEGF、p-AKT蛋白的陽性表達率均顯著高于乳腺腺瘤組織中的陽性表達率(P均<0.05)。見表1。

表1 VEGF-C和p-AKT蛋白在IDC及乳腺腺瘤組織中的表達比較

2.2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與VEGF-C、p-AKT蛋白表達的關(guān)系 與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者比較，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的乳腺IDC組織中VEGF-C、p-AKT蛋白陽性表達率均顯著降低(P均<0.05)。見表2。

表2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與VEGF-C、p-AKT蛋白表達的關(guān)系

2.3乳腺IDC組織VEGF-C、p-AKT蛋白表達的相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，乳腺IDC組織VEGF-C、p-AKT蛋白表達水平呈顯著正相關(guān)(r=0.823，P<0.05)。見表3。

表3 乳腺IDC組織VEGF-C、p-AKT蛋白表達的相關(guān)性分析 例

3 討 論

乳腺IDC是一種涉及多種基因的激活與抑癌基因的失活的基因疾病，基因的突變、缺失與信號蛋白的異常表達在乳腺癌的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要的作用。PI3K/AKT作為調(diào)節(jié)細胞增殖的重要細胞信號通路，可激活生存信號，保持細胞活性，從而有效控制正常血管生長與腫瘤血管形成[5]。AKT是該通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可被PI3K激活為具有磷酸激酶活性的p-AKT，通過激活或抑制caspase-9、NF-κB、mTOR等下游靶蛋白，發(fā)揮抗凋亡作用[6]。VEGF-C是VEGF家族的一員，可誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細胞增殖、遷徙，影響多種腫瘤淋巴管的形成。目前關(guān)于p-AKT、VEGF-C的表達與乳腺IDC的相關(guān)性鮮有報道，且在IDC中 p-AKT與VEGF-C的關(guān)系國內(nèi)也尚未見報道。

本研究結(jié)果顯示，乳腺IDC組織中VEGF、p-AKT蛋白的陽性表達率分別為均顯著高于乳腺腺瘤組織中的陽性表達率(P<0.05)。而在表達陽性強度方面，趨向于癌強度越強，著色越深。提示VEGF、p-AKT蛋白主要由腫瘤細胞分泌，可作為乳腺IDC的標志物。進一步分析發(fā)現(xiàn)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺IDC 組織VEGF-C、p-AKT蛋白陽性表達率顯著降低(P<0.05)。以上說明VEGF-C、p-AKT表達可促進惡性腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。其可能機制是VEGF-C、p-AKT通過抑制凋亡使淋巴管增生，管徑增加，并增加血管的通透性，加速腫瘤細胞游離進入淋巴結(jié)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并向全身擴張[7]。有研究指出，利用miRNA技術(shù)抑制腫瘤細胞VEGF-C、p-AKT表達可減少淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率[8]。因此，筆者認為探討乳腺癌抗淋巴管作用機制及治療方法將是以后靶向研究的重點。

有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞經(jīng)AKT 抑制劑LY294002 處理后，VEGF蛋白的表達顯著下降，且胃癌組織中VEGF的高表達與p-AKT密切相關(guān)[9]。Mehnert等[10]認為，p-AKT可激活NO合酶誘導(dǎo)新生血管形成，促進VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移。但未見對乳腺IDC組織p-AKT和血管生成關(guān)系的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺IDC組織VEGF-C、p-AKT蛋白表達水平呈顯著正相關(guān)，說明p-AKT的高表達可能促進了乳腺IDC新生血管的形成。筆者推測，在IDC中可能存在AKT/VEGF通路，一方面促進細胞的增殖，抑制細胞的凋亡；另一方面可增加VEGF-C的表達，導(dǎo)致腫瘤新血管的生成。二者相互協(xié)調(diào)共同促進乳腺IDC早期發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移。

總之，乳腺IDC組織中VEGF、p-AKT呈過度表達狀態(tài)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期階段起關(guān)鍵作用，而針對性的阻斷PI3K/AKT 通路或者抑制AKT 的活化可能抑制新生血管的生成，從而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，有望為乳腺IDC的治療提供新的思路。

[1] 欒寧, 王雪峰. VEGF-C與腫瘤轉(zhuǎn)移的研究進展[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2009，17(9)：1805-1807

[2] Tsutsui S,Matsuyama A,Yamamoto M,et al. The Akt expression correlates with the VEGF-A and-C expression as well as the microvessel and lymphatic vessel density in breast cancer[J]. Oncol，2010，23(3):621-630

[3] Goo CK，Lim HY，Ho QS，et al. PTEN/Akt signaling controls mitochondrial respiratory capacity through 4EBP1[J]. PLoS One，2012，7(9)：e45806

[4] 許良中，楊文濤. 免疫組化反應(yīng)結(jié)果的判定[J]. 中國癌癥雜志，1996，6(4):229-231

[5] Hamada K，Sasaki T，Koni PA，et al. The PTEN/P13K pathway governs normal vascular development and tumor angiogenesis[J]. Genes Dev，2005，19(17)：2054-2065

[6] Capodanno A,Camerini A,Orlandini C,et al. Dysregulated PI3K/Akt/PTEN pathway is a marker of a short disease-free survival in node-negative breast carcinoma[J]. Hum Pathol，2009，40:1408-1417

[7] Karar J，Maity A. PI3K/AKT/m TOR pathway in angiogenesis[J]. Front Mol Neurosci，2011，4(51)：3389-3392

[8] Ye J,Wu X,Wu D，et al. miRNA-27b targets vascular endothelial growth factor C to inhibit tumor progression and angiogenesis in colorectal cancer[J]. PLoS One，2011，8(4):e60687

[9] KobayashiI,Semba S,Matsuda Y,et al. Significance of AKT phosphorylation on tumor growth and vascular endothelial growth factor expression in human gastriccar cinoma[J]. Patho Biol，2006，73(1):8-13

[10] Mehnert JM,Mc-Carthy MM,Jilaveanu L,et al. Quantitative expression of VEGF, VEGF-R1, VEGF-R2, and VEGF-R3 in melanoma tissue microarrays[J]. Hum Pathol,2010,41(3):375-384

Study on the relation of expression of p-AKT, VEGF-C with the lymph node invasion and metastasis of breast invasive ductal carcinoma

LIU Jun, HUANG Fengde, HU Jintai, YUE Mingquan

(Sichuang Mianyang 404 Hospital, Mianyang 621000, Sichuan, China)

Objective It is to investigate the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), protein kinase B (P-AKT) in breast invasive ductal carcinoma (IDC), and its relation with lymph node invasion and metastasis. Methods The expression of p-AKT, VEGF-C in the tissue of 72 cases of breast IDC and 30 cases of breast fibroadenoma were detected by immunohistochemical staining, the correlation between p-AKT and angiogenesis were analyzed. Results The positive expression rate of p-AKT, VEGF-C protein in breast IDC was 59% and 67% respectively, which was significantly higher than that in breast fibroadenoma of 20% and 17% respectively (2=13.39, 21.21, allP<0.05). The expressions of p-AKT, VEGF-C in breast IDC with lymphnode metastasis were higher than those without lymphnode metastasis (2=11.10, 5.51, allP<0.05). The positive expression rate of VEGF-C had significant positive correlation with that of p-AKT (r=0.823,P<0.05). Conclusion The expression of p-AKT, VEGF-C in breast IDC is over-expressive, and participate the lymphnode invasion and metastasis. Inhibition of PI3K/AKT signal transduction pathway can be expected to provide a new method for the target therapy of breast IDC.

breast invasive ductal carcinoma; vascular endothelial growth factor; protein kinase B; lymphnode metastasis

劉君，女，主治醫(yī)師，從事乳腺外科臨床科研及教學工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.27.002

R737.9

A

1008-8849(2015)27-2968-03

2014-06-30