雙特異性磷酸酶-6基因甲基化在鼻咽癌侵襲轉移中的作用

張松 余坤飛 熊武 袁佛良 吳淑獻 潘松 周軍

雙特異性磷酸酶-6基因甲基化在鼻咽癌侵襲轉移中的作用

張松 余坤飛 熊武 袁佛良 吳淑獻 潘松 周軍

目的探討雙特異性磷酸酶-6(DUSP-6)基因甲基化在鼻咽癌侵襲轉移中的作用。方法 應用甲基化特異性PCR和逆轉錄PCR分別檢測38例鼻咽癌組織和14例慢性鼻咽炎組織中雙特異性磷酸酶-6基因甲基化狀態及其mRNA表達情況。結果 38例鼻咽癌組織中有29例發生雙特異性磷酸酶-6基因甲基化, 14例鼻咽部慢性炎癥組織中無一例發生雙特異性磷酸酶-6基因甲基化。DUSP-6基因甲基化在鼻咽癌各分期中差異無統計學意義(χ2=3.217, P=0.105＞0.05), 而在有淋巴結轉移的鼻咽癌組織中DUSP-6基因甲基化(24/26)明顯高于無淋巴結轉移(5/12)的鼻咽癌組織, 差異有統計學意義(χ2=13.216, P=0.000＜0.05)。甲基化的鼻咽癌組織中雙特異性磷酸酶-6弱或無表達, 非甲基化的鼻咽癌組織和慢性鼻咽炎組織中雙特異性磷酸酶-6強表達。結論 鼻咽癌中雙特異性磷酸酶-6表達與其基因甲基化狀態有關, 雙特異性磷酸酶-6基因甲基化可能是鼻咽癌侵襲轉移的重要因素。

雙特異性磷酸酶-6；甲基化；鼻咽癌；轉移

DNA甲基化是基因表觀遺傳學的主要方式, 許多腫瘤的發生發展與基因的甲基化有關, 尤其是抑癌基因啟動子區高甲基化失活在惡性腫瘤的發生中起重要作用。人類雙特異性磷酸酶-6(dual-specificity phosphatase-6, DUSP-6)是雙特異性磷酸酶家族成員之一, 最近發現它具有腫瘤抑制作用。本研究擬應用甲基化特異性PCR和逆轉錄PCR檢測鼻咽癌組織中雙特異性磷酸酶-6基因啟動子區甲基化及其表達情況,了解DUSP-6基因甲基化在鼻咽癌侵襲轉移中的作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源 本研究中52例鼻咽癌及慢性鼻咽炎組織標本來源于本院因鼻咽部新生物取活檢的患者, 其中鼻咽癌組織38例, 慢性鼻咽炎組織14例。全部鼻咽癌組織經病理診斷均為未分化癌, 按照2002年國際抗癌協會TNM分期標準：Ⅰ期10 例、Ⅱ期11 例、Ⅲ期12 例、Ⅳ期5例, 有淋巴結轉移者26例, 無淋巴結轉移者12例。所有患者在活檢前均未經放療或化療。

1.2 甲基化特異性PCR 應用DNA提取試劑盒［Tiangen Biotech (Beijing) CO., LTD］提取上述組織的DNA, 然后用DNA修飾試劑盒(EZ DNA Methylation-Gold Kit)對上述提取的DNA進行亞硫酸氫鈉處理。根據Gene Bank中DUSP-6基因序列分別設計一對甲基化和非甲基化的擴增引物, 甲基化的引物僅能對鼻咽癌或鼻咽部慢性炎癥組織中DUSP-6基因甲基化的DNA擴增出相應產物, 非甲基化的引物僅能對鼻咽癌或鼻咽部慢性炎癥組織中DUSP-6基因非甲基化的DNA擴增出相應產物。DUSP-6甲基化的引物序列為：5'-ATATAATTTGTTTTAGTCGGTTCGT-3'(正義鏈), 5'-GATTTACTATCTCTTAAACTCAACCTCG-3'(反義鏈)；DUSP-6基因非甲基化的引物為：5'-AATATAATTTGTTTTAGTTGGTTTGT-3'(正義鏈), 5'-CAATTTACTATCTCTTAAACTCAACCTCAC-3'(反義鏈)。甲基化反應條件為：94℃4 min預變性, 變性94℃30 s、退火56℃30 s、延伸72℃30 s 35個循環, 末段延伸72℃5 min。然后將上述產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳成像分析。

1.3 RT-PCR檢測DUSP-6 mRNA表達 取低溫保存的上述各組織約50 mg, 用TRIzol試劑提取總RNA, 然后分別用逆轉錄試劑盒轉錄成cDNA。根據GeneBank中DUSP-6基因序列設計引物, 5'-GTGTCTTGGTACATTGCTTGGC-3'(正義鏈)和5'- GTCATAGGCATCGTTCATCGAC-3' (反義鏈), 作為內參照的β-actin的引物: 5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3' (正義鏈)和5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3' (反義鏈)。反應條件為：95℃預變性 5 min , 然后 95 ℃變性45 s、56℃退火45 s、72℃延伸45 s 35個循環, 最后末段72℃延伸5 min。反應結束后取產物5 μl用2%瓊脂糖凝膠電泳并成像分析。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計分析。計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

甲基化特異性PCR結果顯示, 在DUSP-6基因甲基化的鼻咽癌組織中僅甲基化引物能擴增出甲基化產物, DUSP-6基因非甲基化的鼻咽癌組織中僅非甲基化引物能擴增出非甲基化產物。38例鼻咽癌組織中有29例DUSP-6基因甲基化, 9例為非甲基化, 其中, 臨床分期I期8/10例甲基化, II期8/11例甲基化, III期9/12例甲基化, IV期4/5例甲基化。14例鼻咽部慢性炎癥組織中無一例出現DUSP-6基因甲基化(Fig1)。DUSP-6基因甲基化在鼻咽癌各分期中差異無統計學意義(χ2=3.217, P=0.105＞0.05),而在有淋巴結轉移的鼻咽癌組織中DUSP-6基因甲基化(24/26)明顯高于無淋巴結轉移(5/12)的鼻咽癌組織, 差異有統計學意義(χ2=13.216, P=0.000＜0.05)。

RT-PCR結果顯示DUSP-6基因甲基化的鼻咽癌組織中DUSP-6 mRNA弱表達或不表達, 而DUSP-6基因非甲基化的鼻咽癌組織中DUSP-6 mRNA強表達。

3 討論

雙特異性磷酸酶是指既能對磷酸化酪氨酸去磷酸化, 也能對絲/蘇氨酸殘基去磷酸化的一組蛋白酶, 目前已知大部分雙特異性磷酸酶都在有絲分裂原激活蛋白磷酸酶信號途徑(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)中行使重要生理功能。DUSP6是雙特異性磷酸酶家族的一個成員, 它對MAPKs信號轉導途徑之一的細胞外調節蛋白激酶信號途徑(extracellular-regulated kinases, ERK)有負反饋調控功能, 它的表達高低直接影響ERK信號途徑的轉導作用, 在人類正常組織細胞的生長、增殖、轉化、遷移及各種病理狀態的發生都起著非常重要的作用。最近研究發現, DUSP-6具有抑癌功能,它的高表達可抑制細胞生長、增殖、分化及促進細胞凋亡［1］。已有研究發現, 在早期肺癌和胰腺癌組織中DUSP-6高表達,而在晚期肺癌和胰腺癌組織中DUSP-6低表達, 在DUSP-6低表達的肺癌和胰腺癌細胞系中恢復DUSP-6的表達能抑制癌細胞的生長、增殖, 同時促進癌細胞凋亡。

研究發現, 肺癌中DUSP-6低表達與其基因啟動子區高甲基化有關。DNA甲基化是基因表達遺傳學調控的一種方式。即在DNA序列不變的情況下調節某些特定基因組區域的轉錄活性, 控制該基因的表達。基因啟動子區CpG島甲基化狀態與基因的活性有關, 啟動子區域CpG島高甲基化是基因失活的主要原因之一, 它對基因的滅活是通過抑制該基因轉錄實現的。DNA甲基化在腫瘤的發生中起重要作用,以抑癌基因為代表的CpG島高甲基化所致的基因失活已成為腫瘤表觀遺傳學研究的重要內容。本研究發現38例鼻咽癌組織中有29例DUSP-6基因甲基化(甲基化率為76.3%),且DUSP-6基因甲基化的鼻咽癌組織中DUSP-6 mRNA弱或不表達, 而非甲基化的鼻咽癌組織和鼻咽部慢性炎癥組織中DUSP-6 mRNA強表達, 這說明DUSP-6的表達與其基因甲基化狀態有關。另外, DUSP-6基因甲基化與鼻咽癌是否有頸部淋巴結轉移有關, 這說明DUSP-6基因甲基化狀態可能與鼻咽癌的轉移有關。

總之, DUSP-6的表達與其基因甲基化狀態有關, DUSP-6基因甲基化可能在鼻咽癌侵襲轉移中起重要作用。

［1］ 張松, 李爍, 高春生.uPA基因啟動子區低甲基化在鼻咽癌侵襲轉移中的作用.腫瘤防治研究, 2012, 39(6):691-693.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.31.020

2015-06-11］

深圳市科技計劃項目(醫療衛生類)(項目編號：201203373)

518106 深圳市光明新區人民醫院耳鼻咽喉科