白色念珠菌胃潰瘍分離株和胃癌分離株的毒力及磷脂酶活性差異的實驗研究

易佳麗+劉亞莉+劉劍輝+劉軼群

[摘要]目的 探討胃潰瘍及各期胃癌患者胃黏膜組織中白色念珠菌的毒力及其磷脂酶的活性的差異。 方法按照菌株來源分組為正常對照組，胃潰瘍組，早期胃癌組，進展期胃癌組，各組胃黏膜的菌株在CHROMagar念珠菌顯色培養基上進行真菌分離培養與菌種鑒定，采用蛋黃平板法檢測白色念珠菌的磷脂酶，以Pz值表示磷脂酶的活性。用白色念珠菌懸液尾靜脈注射感染小鼠，以其平均存活時間（d）評價菌株毒力。 結果 與正常對照組比較，各組磷脂酶活性均有所升高，差異有統計學意義，以進展期胃癌組的磷脂酶活力最高，毒力最強，可在5d內致全部小鼠死亡。 結論 隨著胃黏膜病理變化惡性程度的升高，所感染白色念珠菌磷脂酶的活性升高，毒力也逐漸增強。

[關鍵詞]白色念珠菌；胃潰瘍；胃癌；磷脂酶

[中圖分類號]R573 [文獻標識碼]A [文章編號]2095-0616（2014）20-24-03

Experimental study of the differences of virulence and phospholipase activity of Candida albicans in gastric mucosa of patients with gastric ulcer and different stages gastric cancer

YI Jiali1 LIU Yali2 LIU Jianhui3 LIU Yiqun4

1.Administration Office of Medical Vocational Academy， Shenyang 110101， China； 2.Department of Health Inspection， Medical Vocational Academy， Shenyang 110101， China； 3.Department of Inspection Technology， Medical Vocational Academy， Shenyang 110101，China； 4.Department of Statistics， Medical Vocational Academy， Shenyang 110101， China[Abstract]Objective To explore the differences of virulence and phospholipase activity of Candida albicans in gastric mucosa of patients with gastric ulcer and different stages gastric cancer. Methods All the bacterial strain were divided into the normal control group， gastric ulcer group， early gastric cancer group， advanced gastric cancer group according to the sources of strains. The different groups mucosa strains in CHROMagar candida chromogenic medium were fungal isolated and identificated. And the Candida phospholipase was detected by the egg yolk plate method， the phospholipase activity was indicated with Pz values.The Candida albicans suspension was injected into the tail of the mice， and the virulence was evaluated with the mean survival time. Results Compared with the normal control group， the different groups phospholipase activity significantly increased， the difference was significant （P<0.05）. The phospholipase activity in advanced gastric cancer group was the highest， the toxicity was the strongest， and it could make all the mouse death in 5 days. Conclusion With the increase of malignant degree of gastric mucosa， the phospholipase activity of infecting Candida albicans also elevate， the virulence also increase gradually.

[Key words]Candida albicans； Gastric ulcer； Gastric cancer； Phospholipase

胃潰瘍在臨床上屬于癌前疾病，有發生癌變的危險，發生率在1%以下，特別是長期慢性胃潰瘍史、年齡在45歲以上，潰瘍頑固不愈者應提高警惕。胃癌是最常見、最多發和危害最大的惡性腫瘤之一，居全球腫瘤發病和癌癥死亡率的第二位。白色念珠菌是人類常見的條件性致病真菌之一[1]，常常聚居在正常人的皮膚、口腔、陰道和腸道，易感于免疫功能缺陷或抑制、微生態失衡等患者，引起皮膚、黏膜、皮下組織或系統性感染。研究發現，胃潰瘍合并真菌感染者潰瘍口愈合進程明顯延長，潰瘍面積明顯大于單純性潰瘍[2]，其中最常見的真菌菌種就是白色念珠菌。除此之外，胃癌患者尚存在機體免疫功能紊亂、微生態環境失衡等情況，加大了白色念珠菌感染機會，據報道胃癌合并真菌感染者達50%，遠高于正常人群，且大多數的流行病學資料和基礎研究結果均支持白色念珠菌的致癌作用[2]。本實驗以遼寧省腫瘤醫院胃外科手術患者及內鏡室的門診患者的胃黏膜組織為標本，研究胃潰瘍和各期胃癌患者胃黏膜組織中白色念珠菌的毒力及其磷脂酶的表達差異。endprint

1 材料與方法

1.1 標本與菌株

樣本主要來源于遼寧省腫瘤醫院胃外科手術患者及內鏡室的門診患者，正常對照組，胃潰瘍組，早期胃癌組，進展期胃癌組，均選取白色念珠菌感染者每組各10例。

1.2 真菌分離培養與菌種鑒定

在CHROM agar念珠菌顯色培養基上進行（白色念珠菌呈綠色）。經形態學觀察、芽管生成、厚膜孢子形成實驗證實為白色念珠菌。

1.3 蛋白瓊脂培養基配置

將3.215g 沙堡氏葡萄糖瓊脂、NaCl 29.22g （終濃度1molPL）、CaCl2 0.2775g或CaCl2·H2O 0.3675g（終濃度0.005molPL）溶解于500mL蒸餾水中，高壓滅菌，冷卻后加入8%無菌蛋黃40mL。

1.4 磷脂酶的檢測

在蛋黃瓊脂培養基上平放直徑為6mm的圓形消毒濾紙片。白色念珠菌在SDA 上37℃生長24h后，用無菌生理鹽水調節菌懸液濃度，OD520nm值0.075～0.080，滴加6μL菌懸液于培養基中的濾紙上，設無菌蒸餾水滴加6μL的陰性對照組，37℃孵育5d后觀察結果。每一分離株分別重3次實驗。

1.5 磷脂酶活性判定

采用QW500 計算機輔助測量軟件，分別測定濾紙上菌落生長的面積和菌落四周產生的明顯的、界限清晰的、致密白色的沉淀環的面積，然后計算二者面積之比，得Pz值，即為磷脂酶活性[3]取每個菌株的3次重復試驗測量值的平均數作為該菌株的Pz值納入統計處理。根據此計算方法可知Pz值的大小與白色念珠菌的磷脂酶活性大小成反比。Pz>0.95，可認為磷脂酶活性陰性。

1.6 白色念珠菌動物毒力試驗

選用清潔級昆明雌性小鼠（體重18～20g），隨機分組，每組10只小鼠，自1.2項取相應菌株的菌懸液，經4000r/min離心10min，去上清，用無菌鹽水洗菌3次，再用無菌鹽水稀釋成5×106/mL菌懸液，經尾靜脈給小鼠注射此菌液0.2mL，每組菌株接種一組小鼠，對照組小鼠給予無菌鹽水0.2mL尾靜脈注射。逐日觀察小鼠活動情況，連續14d，以小鼠平均生存天數評價菌株毒力。

2 結果

2.1 磷脂酶活力

37℃孵育5d后，蛋黃培養基上各組菌株孢子懸液的部位都有白色菌落的生長，菌落周圍出現白色的沉淀圈，滴加無菌蒸餾水的空白對照組無菌落生長以及白色沉淀圈的生成。計算各組的Pz值，經過統計學處理，結果見表1。與正常對照組比較，各組的磷脂酶活性均有所升高，差異有統計學意義，隨著各組胃黏膜病理變化惡性程度的升高，所感染白色念珠菌的磷脂酶的活性也升高。

2.2 毒力試驗

結果表明隨著胃黏膜病理分型惡性程度的升高。其菌株菌株分泌的磷脂酶的活力越高，對小鼠的毒力也就越強。進展期胃癌組的菌株可在5d內致全部小鼠死亡，胃潰瘍組的菌株在第14天也使小鼠的死亡率達到100%，而正常對照組的菌株使小鼠的死亡率在14d內達到了30%。見表2。

3 討論

白念珠菌是一種重要的條件致病性真菌，它寄居在人體不同的解剖部位，包括皮膚、口腔、胃腸道、陰道等[4]。它是消化道正常菌群成員但非優勢種群，只以胞子形式存在。只在宿主免疫力下降的情況下，其毒力增強、數量變多而成為口腔微生物的優勢種群[5]。文獻資料[6]報道在胃中的白色念珠菌，可能是導致胃部疾病的機制之一。由于胃黏膜受損、黏膜局部循環障礙及細胞免疫功能低下而誘發念珠菌廣泛侵入胃黏膜細胞，在切除的胃癌組織中，念珠菌的分離率亦高達42.0%[7]。白色念珠菌的致病主要與黏附能力、形態轉換和胞外酶有關[8]。本研究結果表明，在各種胃黏膜疾病中，隨著病變的胃黏膜組織的病理分型的惡性程度增高，所感染的白色念珠菌也發生變化，其表達的磷脂酶的活性也逐漸升高，以進展期胃癌組的磷脂酶活性最強。目前已確認，白色念珠菌壁上的？-葡聚糖具有抗腫瘤作用即宿主介導抗腫瘤活性，在白色念珠菌沒轉變成致病菌時，它有抗腫瘤的作用；但其通過粘附能力（甘露聚糖、甘露聚糖蛋白質復合物、幾丁質、受體和粘附素）增強、形態轉換（以菌絲形態生長）、胞外酶（分泌性酸性蛋白酶和磷脂酶）作用而轉變為致病菌后，特別是白色念珠菌形態轉化過程中，？-葡聚糖始終被甘露糖蛋白和幾丁質包圍著，機體免疫系統無法識別？-葡聚糖及殺死致病菌，從而形成腫瘤發生及加重的原因之一[9]。本研究中可以發現，來自不同病理分型的胃黏膜組織的白色念珠菌的磷脂酶的活性大小也不同，我們采用動物實驗的方法證明，隨著胃黏膜病理分型惡性程度的升高。其菌株菌株分泌的磷脂酶的活力越高，對小鼠的毒力也就越強，胃癌患者感染了白色念珠菌后，不但腫瘤的發生發展加快，白色念珠菌的毒力也有所增長。來自胃癌患者腫瘤組織的菌株毒力遠遠大于來自胃潰瘍患者病變組織的菌株毒力，進展期胃癌組的菌株毒力更甚。Kothavade等[10]證實了磷脂酶與小鼠播散性念珠菌病具有明顯的相關性， 認為是白念珠菌血源性感染重要的毒力因子。因此，這種毒力效應并不能排除消化道的正常菌群進入血液后由于菌群易位[11]。白念珠菌作為共棲菌和致病菌與人類共存或在，有許多基因編碼毒力因子[12]，因此白念珠菌間潛在的某種情況下致病還是作為微生態環境改變而引發的毒理效應，還有待進一步研究探討。

[參考文獻]

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（收稿日期：2014-07-14）endprint