鹽酸芐絲肼化學穩(wěn)定性影響因素的研究

馬桂芝　李文英　王娟　賀鑫韜　馬文娜　滕亮

[摘要] 目的 考察影響鹽酸芐絲肼穩(wěn)定性的因素。 方法 建立用于測定鹽酸芐絲肼含量的高效液相色譜法。在此基礎(chǔ)上，考察溶劑pH、光線、氧氣、溫度、濕度對鹽酸芐絲肼穩(wěn)定性的影響。 結(jié)果 所建立的含量測定方法符合方法學要求。考察結(jié)果表明，溶劑的pH越大，鹽酸芐絲肼越不穩(wěn)定；光線對鹽酸芐絲肼穩(wěn)定性有影響，需遮光保存；在氧氣的作用下，鹽酸芐絲肼會發(fā)生氧化現(xiàn)象，加入相對于藥物的質(zhì)量分數(shù)25%的維生素C后，12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；溫度與濕度的變化對鹽酸芐絲肼化學穩(wěn)定性有影響。 結(jié)論 通過控制外部條件，有望改善鹽酸芐絲肼的化學穩(wěn)定性。

[關(guān)鍵詞] 鹽酸芐絲肼；高效液相色譜法；化學穩(wěn)定性；影響因素

[中圖分類號] R971.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）12（b）-0004-05

帕金森病（Parkinson's disease，PD）又稱為震顫麻痹，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)錐體外系功能障礙的慢性進行性疾病[1]。美國神經(jīng)協(xié)會對各種抗PD藥物進行評估，結(jié)果表明復方左旋多巴制劑（美多芭等）是所有PD藥物治療中最有效的藥物[2-3]。但是該片劑使用方法繁瑣，給藥頻率高，中老年患者的用藥順應(yīng)性差，同時左旋多巴的吸收主要發(fā)生在胃和小腸近端（主要在十二指腸和空腸部位）[4]，普通左旋多巴片劑在胃內(nèi)停留時間短，吸收量有限[5]，因此許多研究者都致力于復方左旋多巴緩釋制劑的研究[6-9]。因此課題組結(jié)合前期研究結(jié)果[10-11]，嘗試采用復合制劑技術(shù)將普通片研發(fā)成既可保證藥物的療效又能增加患者用藥順應(yīng)性的微囊胃漂浮片[12-14]，以滿足臨床用藥需求。該微囊胃漂浮片是由左旋多巴的微囊與鹽酸芐絲肼的固體分散體作為中間體，與適宜輔料壓制而成的片劑。

根據(jù)課題設(shè)計需要，制備的緩釋制劑應(yīng)滿足12 h連續(xù)釋放的要求，但是預試驗結(jié)果表明鹽酸芐絲肼在稀鹽酸（9→1000 mL）中只能保證8 h內(nèi)穩(wěn)定。因此在進行芐絲固分體制備工藝篩選之前，先考察了鹽酸芐絲肼穩(wěn)定性及其影響因素，為后續(xù)鹽酸芐絲肼固體分散體的處方篩選奠定實驗基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

數(shù)顯恒速攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司，S312-60型）；高效液相色譜儀（日本島津，LC-20A型）；真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司，DZF-6090型）；電子天平（北京賽多利斯天平有限公司，BS110S型）。

1.2 試藥

鹽酸芐絲肼（湖北中和化工，批號：100511）；鹽酸芐絲肼對照品（Sigma-Aldrich，批號：SL09032）；抗壞血酸（上海山浦化工有限公司，批號：20100504）；無水乙醇（安徽安特生物化學有限公司，批號：0808073601）；聚維酮（PVP，新疆華世丹藥業(yè)，批號：060614）；鹽酸（烏魯木齊天岳化學試劑有限公司，批號：070917）；氫氧化鈉（天津市福晨化學試劑廠，批號：20090909）；司盤-80（天津市福晨化學試劑廠，批號：060907）。液狀石蠟（天津市富宇精細化工有限公司，批號：090703）；乙酸乙酯（天津市福晨化學試劑廠，批號：20100705）；鄰苯二甲酸二乙酯（天津市福晨化學試劑廠，批號：20101110）。十二烷基硫酸鈉（上海市四赫維化工有限公司，批號：20080415）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，其中一級動力學方程以lgC對t進行直線回歸獲得。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 方法與結(jié)果

2.1 固體分散體中鹽酸芐絲肼的含量測定方法

2.1.1 測定波長的確定 以稀鹽酸（9→1000 mL）為介質(zhì)配制0.1 mg/mL的鹽酸芐絲肼對照品溶液。精密量取鹽酸芐絲肼對照品溶液3 mL置于10 mL量瓶中，加稀鹽酸（9→1000 mL）至刻度，搖勻，在200～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示該溶液在220 nm波長處有最大吸收。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：三氟乙酸-甲醇-水=1∶20∶1000；流速：0.5 mL/min；檢測波長：220 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30℃。在上述條件下，鹽酸芐絲肼達到基線分離，分離度大于1.5，以鹽酸芐絲肼峰計算柱效，其理論塔板數(shù)（n）均在5000以上，取陰性對照溶液進樣，結(jié)果表明，陰性對照在主藥峰位置處沒有相應(yīng)峰出現(xiàn)。陽性對照品、供試品和陰性樣品的高效液相色譜圖分別見圖1。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密稱取鹽酸芐絲肼標準品0.0125 g，用稀鹽酸（9→1000 mL）定容至50 mL容量瓶制成儲備液，分別精密吸取儲備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL儲備液置于10 mL量瓶中，稀鹽酸（9→1000 mL）定容，搖勻。用高效液相色譜法于220 nm處測定各溶液的峰面積（A），以峰面積（A）對濃度（C）進行線性回歸，鹽酸芐絲肼回歸方程為A = 1.139 89×10-5C+0.7215，r = 0.9996（n = 8），表明吸光度與濃度在2.448～58.752 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗 精密吸取上述對照品溶液，重復進樣6次，結(jié)果顯示鹽酸芐絲肼峰面積的RSD為1.29%。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取樣品溶液分別在0、2、4、6、8 h時進樣測定，結(jié)果顯示鹽酸芐絲肼峰面積的RSD為1.04%。實驗結(jié)果提示：該樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復性試驗 取供試品溶液，重復進樣6次，結(jié)果顯示鹽酸芐絲肼峰面積的RSD為1.05%。

2.1.7 加樣回收率試驗 分取已知含量供試品9份，分別精密加入高、中、低質(zhì)量濃度對照品溶液各3份，按色譜條件，通過液相色譜儀測定峰面積，計算回收率，結(jié)果顯示鹽酸芐絲肼的平均回收率為99.66%，RSD為0.79%。見表1。

2.2 鹽酸芐絲肼化學穩(wěn)定性的影響因素

2.2.1 溶劑pH對穩(wěn)定性的影響 用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)制不同pH的水溶液作為溶劑溶解等量鹽酸芐絲肼[15-16]，考察不同pH下鹽酸芐絲肼含量隨時間變化的變化，結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)處理結(jié)果表明不同pH下鹽酸芐絲肼含量變化規(guī)律可用一級動力學方程擬合。結(jié)果表明隨著放置時間的延長，鹽酸芐絲肼含量增均呈降低趨勢。溶劑的pH越大，鹽酸芐絲肼越不穩(wěn)定，且由降解速率常數(shù)大可見pH對其化學穩(wěn)定性的影響較為顯著。而稀鹽酸（9→1000 mL）的pH為1.2，可以提供鹽酸芐絲肼較穩(wěn)定的pH環(huán)境。

2.2.2 光線對穩(wěn)定性的影響 用稀鹽酸（9→1000 mL）溶解2份等量鹽酸芐絲肼，1份在遮光條件下保存，2份在未遮光的條件下保存，平行實驗3次，考察鹽酸芐絲肼含量隨時間的變化，結(jié)果見表3。統(tǒng)計學結(jié)果表明當放置時間達到12 h時兩種條件下的鹽酸芐絲肼含量差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。速率方程也表明光線對鹽酸芐絲肼穩(wěn)定有影響，隨著放置時間的延長，鹽酸芐絲肼含量均呈降低趨勢，但是未遮光組鹽酸芐絲肼含量降低的速度更快。以上結(jié)果提示遮光保存有利于增加鹽酸芐絲肼的穩(wěn)定性。

2.2.3 氧氣對芐絲肼穩(wěn)定性的影響 稀鹽酸（9→1000 mL）溶解3份等量鹽酸芐絲肼，其中1份空白，1份加入相對于藥物的質(zhì)量分數(shù)10%的抗氧劑抗壞血酸（維生素C），1份加入25%的維生素C，平行實驗3次，考察鹽酸芐絲肼含量隨時間變化的變化，結(jié)果見表4。加入相對于藥物質(zhì)量分數(shù)10%維生素C，12 h后與不加抗氧劑的空白溶液相比，鹽酸芐絲肼平均含量有提高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。加25%維生素C，10、12 h后與不加抗氧劑的空白溶液相比，鹽酸芐絲肼平均含量明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。速率方程也表明氧氣含量對鹽酸芐絲肼穩(wěn)定有影響，隨著放置時間的延長，鹽酸芐絲肼含量均呈降低趨勢，但是加25%維生素C的鹽酸芐絲肼含量降低的速度最慢。綜合以上實驗結(jié)果分析，鹽酸芐絲肼會發(fā)生氧化現(xiàn)象，加入了25%抗氧劑后維生素C，12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 溫度對穩(wěn)定性的影響 分別將等量鹽酸芐絲肼原藥粉放在60、40、25℃ 3個溫度環(huán)境下遮光干燥保存10 d，于第5、10天取樣溶于等量稀鹽酸（9→1000 mL）中測其百分含量變化。見表5。結(jié)果顯示溫度的變化對鹽酸芐絲肼有影響，溫度越高穩(wěn)定性越差。

2.2.5 濕度對穩(wěn)定性的影響 將等量鹽酸芐絲肼原藥粉分別放在室溫下，相對濕度為75%、60%、0%的環(huán)境下遮光保存10 d，于第5、10天取樣溶于等量稀鹽酸（9→1000 mL）測其百分含量。見表6。結(jié)果顯示鹽酸芐絲肼對濕度很敏感，在干燥環(huán)境下較穩(wěn)定。

3 討論

鹽酸芐絲肼為脫羧酶抑制藥，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于丙酮，其化學結(jié)構(gòu)特點決定該化合物有可能對空氣、光線、溫度、濕度等敏感。因此本研究選擇其標示百分含量為穩(wěn)定性考察指標，建立了體外測定芐絲肼含量的高效液相色譜法，方法學考察結(jié)果表明該方法符合專屬、準確、靈敏、精密的要求，可用于考察不同影響因素對芐絲肼化學穩(wěn)定性的影響。

穩(wěn)定性是藥物的基本屬性之一。藥物的化學穩(wěn)定性是指藥物由于水解、氧化等化學降解反應(yīng)，使藥物含量（或效價）、色澤產(chǎn)生變化。采用合適的分析方法，考察不同條件（如溫度、濕度、光線等）下藥品主要質(zhì)量指標隨時間的變化情況，為藥物制劑的處方設(shè)計提供依據(jù)，是藥物制劑處方前期研究的重要內(nèi)容。因此本研究在前期預試驗的基礎(chǔ)上結(jié)合制劑的設(shè)計要求（所設(shè)計的漂浮制劑要求在胃液中可持續(xù)漂浮12 h），考察了溶劑pH、光線、氧氣、溫度、濕度在不同時間點對鹽酸芐絲肼穩(wěn)定性的影響。

研究結(jié)果提示：①溶劑的pH越大，鹽酸芐絲肼越不穩(wěn)定，說明將鹽酸芐絲肼制備成胃內(nèi)漂浮片對其化學穩(wěn)定性影響較小。②光線對鹽酸芐絲肼穩(wěn)定性有影響，提示在制備鹽酸芐絲肼固體分散體的過程中需要避光，同時該漂浮片需遮光保存。③在氧氣的作用下，鹽酸芐絲肼會發(fā)生氧化現(xiàn)象，加入了25%抗氧劑維生素C后，12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，提示在固體分散體的處方優(yōu)選過程中需要考慮引入抗氧劑以增加制劑的化學穩(wěn)定性。④溫度的變化對鹽酸芐絲肼有一定影響。⑤濕度的變化會造成鹽酸芐絲肼化學穩(wěn)定性的顯著改變，這可能是因為鹽酸芐絲肼為水溶性化合物，具有較強的吸水性，吸水后液層中的鹽酸芐絲肼極易發(fā)生化學改變。對各影響因素的影響程度進行初步分析，可認為環(huán)境濕度、溶液pH對鹽酸芐絲肼的化學穩(wěn)定性影響較為顯著，其次為氧氣的影響，影響較小的因素為光照與環(huán)境溫度，因此在后續(xù)固體分散體處方設(shè)計時尤其要關(guān)注影響較為顯著的因素。

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（收稿日期：2014-09-07 本文編輯：衛(wèi) 軻）