王勇,張錦玲,張立明,郭鵬,袁麗佳,劉大程*
(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特010018;2.農(nóng)業(yè)部動物臨床診療技術(shù)重點實驗室,內(nèi)蒙古呼和浩特010018)
復(fù)合酵母菌固態(tài)發(fā)酵動力學(xué)模型的建立
王勇1,2,張錦玲1,2,張立明1,2,郭鵬1,2,袁麗佳1,劉大程1,2*
(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特010018;2.農(nóng)業(yè)部動物臨床診療技術(shù)重點實驗室,內(nèi)蒙古呼和浩特010018)
對復(fù)合酵母菌固態(tài)發(fā)酵動力學(xué)模型進行研究,并通過干重法確定發(fā)酵過程菌體生物量。采用Logistic方程,Luedeking-Piret方程和Luedeking-Piret/like方程進行最優(yōu)參數(shù)估計和非線性擬合,得到了描述發(fā)酵過程中菌體生長、β-葡聚糖和甘露聚糖合成、底物總糖消耗的動力學(xué)模型,通過對Luedeking-Piret模型的計算,可知β-葡聚糖和甘露聚糖合成與菌體合成是偶聯(lián)的。對試驗數(shù)據(jù)與模型預(yù)測值進行比較,發(fā)現(xiàn)平均相對誤差都小于10%,說明模型反映了復(fù)合酵母菌發(fā)酵過程的動力學(xué)特征,表明該動力學(xué)模型對指導(dǎo)生產(chǎn)具有實際意義。
復(fù)合酵母菌;固態(tài)發(fā)酵;β-葡聚糖;甘露聚糖;動力學(xué)模型
復(fù)合酵母培養(yǎng)物是一種含有少量活菌細(xì)胞、大量細(xì)胞代謝產(chǎn)物和發(fā)酵培養(yǎng)基組成的混合物,其核心價值在于它含有的發(fā)酵代謝物,主要分為營養(yǎng)代謝物(包括多糖、多肽、有機酸、氨基酸、酶類等)、增味劑和芳香物質(zhì)、酶類及其他對促進畜禽生長有益的未知因子等。這些營養(yǎng)活性物質(zhì)在調(diào)控瘤胃功能和提高反芻動物免疫功能方面發(fā)揮出積極的功效[1-2]。但在前期科研工作中也發(fā)現(xiàn)復(fù)合酵母菌培養(yǎng)物在固態(tài)發(fā)酵過程存在著缺陷:培養(yǎng)物中活性物質(zhì)的產(chǎn)生規(guī)律及含量不清楚;發(fā)酵工藝多依靠技術(shù)工人的經(jīng)驗來控制,缺乏科學(xué)數(shù)據(jù)的支持;發(fā)酵結(jié)束后復(fù)合菌培養(yǎng)物質(zhì)量的均一性較差,產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。
近幾年,國內(nèi)學(xué)者對發(fā)酵動力學(xué)模型的研究較多。王二強等[3]對以甜高粱稈為基本原料固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的過程建立動力學(xué)模型,對指導(dǎo)乙醇固態(tài)發(fā)酵的放大和生產(chǎn)具有實際意義。魏培蓮等[4]對土曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀(lovastatin)的過程進行了研究,建立了土曲霉固態(tài)發(fā)酵的動力學(xué)模型。固態(tài)發(fā)酵動力學(xué)研究主要集中在生產(chǎn)酒精及產(chǎn)纖維素酶兩個方面,以β-葡聚糖、甘露聚糖為產(chǎn)物建立動力學(xué)模型研究鮮見報道。菌體生長動力學(xué)模型建立時,多以測定菌體細(xì)胞組分含量為主(如葡萄糖胺[5]、核酸[5]和麥角固醇[5]),但這些方法通常較復(fù)雜,且發(fā)酵基質(zhì)成分對結(jié)果也可能會產(chǎn)生干擾[6]。TEREBIZNIK M R等[8-10]通過測定發(fā)酵過程中發(fā)酵料干質(zhì)量的變化建立了估算發(fā)酵不同階段菌體生物量的數(shù)學(xué)模型。
本研究建立的動力學(xué)模型以生產(chǎn)實際為基礎(chǔ),通過測定發(fā)酵基質(zhì)干質(zhì)量的變化估算菌體生物量,建立菌體生成動力學(xué)模型,以β-葡聚糖、甘露聚糖為活性產(chǎn)物建立產(chǎn)物生成動力學(xué)模型,應(yīng)用這些模型對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化,對發(fā)酵過程進行預(yù)測及控制,為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)綠色飼料添加劑提供有力的理論基礎(chǔ)。
1.1 材料與試劑
釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)BC株、XR4株,均來源于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院反芻動物微生態(tài)制劑項目組菌種庫。
酵母菌活化培養(yǎng)基采用麥芽汁培養(yǎng)基:麥芽膏粉130 g,氯霉素0.1 g。
固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基[11]:麩皮52.69%、玉米片20.45%、玉米粉16.07%、米糠4.09%、棉粕1.86%、豆粕3.99%和無機鹽0.85%。
β-葡聚糖、甘露聚糖、鉛化玻璃珠(粒徑0.45~0.60mm):美國Sigma-Aldrich公司。
1.2 儀器與設(shè)備
LC1100高效液相色譜儀:美國安捷倫科技有限公司;T6系列紫外可見分光光度計:北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Thermo Scientific MSC1.8生物安全柜:德國Thermo Fisher公司;HPS-160恒溫生化培養(yǎng)箱:哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;2-16pk高速低溫冷凍離心機:美國Sigma-Aldrich公司;BSA22025精密電子分析天平:德國Sartorius公司。
1.3 試驗方法
1.3.1 試驗菌種制備
取4℃保存的BC、XR4斜面菌種3環(huán),接種于含有300mL無菌麥芽汁培養(yǎng)基的1.5 L三角瓶中,于30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h后接種于50 L液體發(fā)酵罐中,30℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。
固態(tài)發(fā)酵:發(fā)酵料水比為1.00∶0.52(g∶mL),充分?jǐn)嚢韬螅瑢⒒旌虾玫陌l(fā)酵料堆放于發(fā)酵池(2 m×1.5 m×1.5 m)內(nèi),料高55 cm。
1.3.2 采樣
用采樣器每隔3 h從固態(tài)發(fā)酵料表層下15~20 cm處均勻取樣100 g,緯線圈法[12]取樣225 g,混合均勻后,平均分為9份,3份樣品用于測定干質(zhì)量,3份樣品用于測定葡聚糖和甘露聚糖,剩下3份在80℃條件下烘干至質(zhì)量恒定,用于測定底物總糖。
1.3.3 底物干質(zhì)量測定
稱取不同時間的樣品16g,80℃烘干至質(zhì)量恒定,稱質(zhì)量[9]。
1.3.4 葡聚糖和甘露聚糖含量的測定
酵母破壁:渦流微珠破壁法[13]。
收集多糖:處理后的樣品用冷卻的去離子水充分清洗,收集玻璃珠,并收集洗液,重復(fù)5次。沉淀物加入3 mL去離子水,充分振蕩,收集洗液,重復(fù)5次,合并洗液。將所得液體55℃靜置24 h蒸發(fā)水分[14]。
酸水解:多糖溶液加1.5 mL,72%的硫酸溶液,混勻,室溫條件下靜置3 h;然后加入7.7 mL去離子水使硫酸的最終濃度為2 mol/L,置于100℃水解4 h,取出冷卻至室溫后調(diào)pH為6.5~7.0,再用去離子水定容至25 mL[15]。
單糖含量測定色譜條件:采用高效液相色譜-示差折光檢測器測定樣品及校正多糖中甘露糖和無水葡萄糖含量[16]。用Ca型陽離子交換柱進行分離;以相對保留時間定性,色譜峰面積定量。流動相:100%水;柱溫:90 ℃;流速:0.5 mL/min。
樣品測定:以校正多糖的含量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)制備校正曲線,得出回歸方程。樣品的峰面積代入回歸方程中計算得到酵母β-葡聚糖及甘露聚糖含量。
1.3.5 底物總糖測定
采用苯酚-硫酸法[17]。
2.1 菌體生長動力學(xué)模型的建立
2.1.1 底物干重變化與菌體生物量關(guān)系的確定
在固態(tài)發(fā)酵過程中,將底物烘干后,底物組成為[10]:
根據(jù)BORZANI W等[10]研究可得:
式中:W為發(fā)酵料干質(zhì)量,g;S為固態(tài)基質(zhì)干質(zhì)量,g;B為菌體生物量,g/g;P為產(chǎn)物質(zhì)量,g/g;dW/dt為發(fā)酵料干質(zhì)量變化率,g/h;dS/dt為固態(tài)基質(zhì)消耗速率,g/h;dB/dt為菌體生長速率,g/h;dP/dt為產(chǎn)物生成速率,g/h。
在固態(tài)發(fā)酵過程中,底物的消耗主要由于菌體生長,維持菌體生長和生成產(chǎn)物造成[17],因此,可將式(2)變換為:
其中,
式中:(dS/dt)g為菌體生長消耗固態(tài)基質(zhì)速率,g/h;(dS/dt)m為菌體維持消耗固態(tài)基質(zhì)速率,g/h;(dS/dt)p為產(chǎn)物生成消耗固態(tài)基質(zhì)速率,g/h;Yg為菌體生物量相關(guān)系數(shù);YP為產(chǎn)物生成相關(guān)系數(shù);-km為維持菌體相關(guān)系數(shù)。
通過式(1)~(6)可得出底物干質(zhì)量與菌體生物量的關(guān)系:
式中:γ,δ,k1和k2均為方程常數(shù)。
由BORZANI W等[10]的研究可知,固態(tài)發(fā)酵過程中底物干質(zhì)量變化主要可分為2個階段,結(jié)合圖1中底物干質(zhì)量變化可知,0~21 h為第1階段,21~30 h為第2階段,方程分別為:
式中:W1為第1階段發(fā)酵料干質(zhì)量,g;W2為第2階段發(fā)酵料干質(zhì)量,g;W0為發(fā)酵料起始干質(zhì)量,g;B0為初始菌體生物量,g/g;μ為菌體生長比生長率,1/h,t為發(fā)酵時間,h;ta為第1階段結(jié)束時間,h;tb為第2階段結(jié)束時間,h;kt為方程常數(shù)。
由式(7)~(11)可得底物干質(zhì)量的變化與菌體生物量的方程:
式中:Bs為不同時間菌體生物量,g/g。
將底物干質(zhì)量結(jié)果帶入式(10)和式(11)中,利用Origin 8軟件進行曲線擬合,不同階段擬合曲線見圖1和圖2,擬合方程式:
對式(13)和(14)進行微分,得:
方程(13)和(14)的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9781和0.9673,方程均極顯著(P<0.000 1),表明方程計算所得干質(zhì)量值可以分別解釋第1階段97.81%的干質(zhì)量變化和第2階段96.73%的干質(zhì)量變化,說明曲線擬合度較好。
由式(10)、(12)、(13)和(15)可得第1階段菌體生物量的表達(dá)式:
由式(11)、(12)、(14)和(16)可得第2階段菌體生物量的表達(dá)式:
式中:B21表示第21小時菌體生物量,g/g。
2.1.2 Logistic模型的建立
Logistic模型是一個典型的S型曲線,通常被看作是一個表現(xiàn)細(xì)胞生長與營養(yǎng)物質(zhì)之間的非線性關(guān)系的經(jīng)驗方程,能很好地反映該過程中菌體濃度增加對自身生長的抑制作用[18],因此,采用此模型描述復(fù)合酵母生長動力學(xué)特性,Logistic方程[19]:
式中:Bm為最大菌體生物量,g/g;μm為菌體生長最大比生長率,1/h。
通過方程(17)和(18)計算所得生物量數(shù)據(jù)利用Origin8軟件進行擬合,擬合曲線見圖2,參數(shù)估計值見表1。
則復(fù)合酵母菌固態(tài)發(fā)酵菌體生長動力學(xué)模型為:
方程(21)的相關(guān)系數(shù)R2為0.961 3,方程極顯著(P<0.001),表明方程曲線擬合度較好,可以描述復(fù)合酵母菌在發(fā)酵過程中的生長情況。
2.2 產(chǎn)物生成動力學(xué)模型的建立
本研究用Luedeking-Piret方程來描述β-葡聚糖,甘露聚糖和菌體生長的關(guān)系[18],即:
式中:α、β為動力學(xué)參數(shù),當(dāng)α=0,β≠0時,產(chǎn)物生成與菌體生長為非偶聯(lián)型;α≠0,β≠0時,產(chǎn)物生成與菌體生長為部分偶聯(lián)型;α≠0,β=0時,產(chǎn)物生成與菌體生長為偶聯(lián)型。
本研究中,β-葡聚糖和甘露聚糖為酵母細(xì)胞壁的主要成分,其中β-葡聚糖為酵母細(xì)胞壁的主要多糖[19-21],由于以β-葡聚糖和甘露聚糖建立Luedeking-Piret方程研究較少,因此,對模型的建立進行分類討論。
(1)假設(shè)β-葡聚糖和甘露聚糖的生成模型為偶聯(lián)型,即當(dāng)β=0時,式(22)可簡化為:
當(dāng)t=0時,P=P0,將方程(19)帶入方程(23)中,可得:
對式(24)積分得:
式中:P0為起始產(chǎn)物質(zhì)量,g/g;P為不同時間點葡聚糖和甘露聚糖含量,g/g。
將不同時間點葡聚糖和甘露聚糖含量的P,以及B、P0、B0帶入式(25)中,利用Matlab 7.0軟件,依最小二乘法求回歸系數(shù),可得:α1=6.08,α2=1.96(α1為β-葡聚糖生成動力學(xué)參數(shù),α2為甘露聚糖生成動力學(xué)參數(shù))。
(2)假設(shè)β-葡聚糖和甘露聚糖的生成模型為部分偶聯(lián)型,即β≠0,
當(dāng)t=0時,P=P0,將方程(19)帶入方程(22)中,可得:
對式(26)積分可得:
將不同時間點葡聚糖和甘露聚糖含量的P,以及B、P0、B0帶入式(27)中,利用Matlab 7.0軟件,依最小二乘法求回歸系數(shù),可得:α1=8.3584,β1=-1.03×10-4,α2=1.96,β2=-3.26×10-5(β1為β-葡聚糖生成動力學(xué)參數(shù),β2為甘露聚糖生成動力學(xué)參數(shù))。
由于β1和β2的值近似為0,因此,可知兩種產(chǎn)物的生成與菌體的生長為偶聯(lián)型,則可得:
β-葡聚糖生成模型:
甘露聚糖生成模型:
方程(28)和(29)相關(guān)系數(shù)R2分別為0.935 2和0.928 8,方程均極顯著(P<0.000 1),表明所選方程可以較好的反映產(chǎn)物生成的實際情況,相關(guān)性結(jié)果見圖3。
酵母發(fā)酵過程中,總糖的消耗與產(chǎn)物合成僅有間接關(guān)系,假設(shè)基質(zhì)的消耗用于產(chǎn)物合成的比例很小,可忽略不計,認(rèn)為總糖的消耗僅用于菌體的生長,所以式(30)可簡化為:
2.3 底物消耗動力學(xué)模型的建立
常用的底物消耗動力學(xué)模型是基于底物消耗物料恒算建立的Luedeking-Piret/like方程式[22],即:將式(19)帶入式(31)積分得:
式中:St為底物總糖含量,g/g;St0為起始底物總糖含量,g/g;YB/t為總糖用于菌體生長的得率常數(shù);Yp/t為總糖用于產(chǎn)物累計得率常數(shù);K為維持常數(shù)。
將不同時間點的B,St和B0帶入式(32)中,利用Matlab 7.0軟件,依最小二乘法求回歸系數(shù),可得:
St0=0.121g,YB/t=0.099。
則可得底物消耗動力學(xué)模型為:
方程(33)相關(guān)系數(shù)R2為0.990 7,方程均極顯著(P<0.000 1),表明的所選方程可以很好的反映底物消耗的實際情況,相關(guān)性分析結(jié)果見圖4。
2.4 模型準(zhǔn)確性分析
為了驗證模型的準(zhǔn)確性,在相同條件下進行復(fù)合酵母菌固態(tài)發(fā)酵的重復(fù)試驗3次,與動力學(xué)模型計算值進行比較,結(jié)果見表2。由表2可知,菌體生物量、甘露聚糖含量、β-葡聚糖含量和底物總糖含量的相對誤差都小于10%,說明建立的動力學(xué)模型能較好的描述生產(chǎn)實際中復(fù)合酵母菌固態(tài)發(fā)酵過程。
以固態(tài)發(fā)酵料干質(zhì)量變化為基礎(chǔ),建立了復(fù)合酵母菌菌體生物量生長Logistic動力學(xué)模型相關(guān)系數(shù)R2為0.961 3,方程極顯著(P<0.001),通過模型驗證,模型平均相對誤差為4.83%,表明在生產(chǎn)實際中復(fù)合酵母菌的生長符合Logistic方程。
通過對Luedeking-Piret方程參數(shù)α和β分類討論并計算,發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖與甘露聚糖的生成與酵母菌為偶聯(lián)型,其中β-葡聚糖生成模型P=0.070 14+6.08(B-0.004 46),甘露聚糖生成模型P=0.035 4+1.96(B-0.004 46),相關(guān)系數(shù)R2分別為0.935 2,0.928 8,平均相對誤差分別為4.19%和4.08%,方程均極顯著(P<0.000 1)。底物消耗動力學(xué)模型St=0.121+10.11(B-0.004 46),相關(guān)系數(shù)R2為0.990 7,平均相對誤差為6.1%,方程極顯著(P<0.000 1),說明模型可較好描述發(fā)酵過程,對優(yōu)化實際生產(chǎn)工藝,控制和預(yù)測發(fā)酵過程具有重要的參考價值。
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WANG Yong1,2,ZHANG Jinling1,2,ZHANG Liming1,2,GUO Peng1,2,YUAN Lijia1,LIU Dacheng1,2*
(1.College of Veterinary Medicine,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China;2.Ministry of Agriculture Key Laboratory of Animal Clinical Diagnosis Technology,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)
The kinetics model of solid state fermentation by compound yeast was studied and the biomass was determined based on dry weight variation.The optimal parameters were estimated and nonlinear fitting was performed by logistic model,Luedeking-Piret equation and Luedeking-Piret/like equation.The kinetics model of biomass growth,β-glucan production,mannan synthesis and total sugar consumption were established, respectively.Through the calculation on Luedeking-Piret model,the results showed that the synthesis of β-glucan and mannan was link-coupled with cell.The experimental data were compared with the predicted ones,it showed the average relative error was generally less than 10%,which indicated that the kinetic models can reflect the dynamic characteristics of composite yeast fermentation process.The results showed that the models can guide the practical production significantly.
compound yeast;solid-state fermentation;β-glucan;mannan;kinetic model
S816
A
0254-5071(2015)04-0066-06
10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.015
2015-03-06
國家自然科學(xué)基金項目(31260560);內(nèi)蒙古科技廳專利轉(zhuǎn)化項目(20140185);內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)科技成果轉(zhuǎn)化項目(CGZH2013007)
王勇(1988-),男,碩士研究生,研究方向為反芻動物微生態(tài)制劑。
*通訊作者:劉大程(1968-),男,教授,博士,研究方向為反芻動物微生態(tài)制劑。