HPLC測定不同廠家發酵型茶葉中阿魏酸含量

陳錦，胡茂豐，文欣，吳章華，劉素純，5*

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南長沙410128；2.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙410128；3.湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南長沙410128；4.長沙市調料食品工程技術研究中心，湖南長沙410000；5.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙410128）

HPLC測定不同廠家發酵型茶葉中阿魏酸含量

陳錦1，胡茂豐2，文欣3，吳章華4，劉素純1，5*

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南長沙410128；2.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙410128；3.湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南長沙410128；4.長沙市調料食品工程技術研究中心，湖南長沙410000；5.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙410128）

采用高效液相色譜法測定不同廠家發酵型茶葉中阿魏酸的含量，色譜條件為Shimpack VP-ODS C18（150 mm×6 mm，5 μm）色譜柱，流動相為0.2%冰醋酸-甲醇（28∶72），檢測波長314 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min。結果表明，阿魏酸在20～100 μg/mL范圍內線性良好（相關系數R2=0.999 8），平均加樣回收率為98.73%，相對標準偏差（RSD）為1.71%。測得9個廠家不同發酵型茶葉中阿魏酸的含量在22.559～30.286 μg/g，其中湖南益陽的湘益茯磚茶阿魏酸含量最高，為30.286 μg/g。該方法簡便快速，適用于發酵型茶葉中阿魏酸含量的測定。

阿魏酸含量；發酵型茶；高效液相色譜；檢測條件

發酵型茶是中國傳統茶類之一，生產歷史悠久，早在11世紀前后就有有關于茶蒸制成團塊，堆積20多天使其變色的記載，因其獨特的品質風味，深受人們喜愛。微生物在其渥堆過程中起到關鍵作用，GREENWALT C J等[1]研究表明，經微生物發酵后的茶比綠茶具有更高的生物活性，這種活性主要來源于酚酸類物質。阿魏酸是桂皮酸的衍生物，是普遍存在的一種酚酸，具有抗氧化[2]、抗血栓[3]、降血脂[4]、抗菌消炎[5]以及抗突變防癌[6]等功能。其含量測定方法的報道有很多，主要有氣相色譜法[7]、薄層顯色掃描法[8]、紫外分光光度法[9]及高效液相色譜法[10]。但目前，國內外大多研究集中在茶葉中沒食子酸[11]、原兒茶酸[12]、咖啡酸[13]、蘆丁[14]等，少見發酵型茶中阿魏酸含量測定的相關文獻報道。本實驗就提高阿魏酸的穩定性及高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定阿魏酸含量的方法進行了探討，并用HPLC法測定了不同廠家生產的不同的幾種典型發酵型茶中阿魏酸的含量，并進行比較分析，為發酵型茶葉中阿魏酸含量的質量控制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉樣品為市場購買的黑毛茶，中藥粉碎機粉碎過100目篩后備用；茯磚茶、普洱茶、青磚茶3種茶葉各選3個不同茶廠生產的產品作為測定的樣品，中藥粉碎機粉碎過100目篩后，備用。

甲醇（色譜純）、冰醋酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；水為超純水；其他試劑均為國產分析純；阿魏酸標樣：上海紫一試劑廠。

1.2 儀器與設備

Waters 2695高效液相色譜儀、Waters 2996二級管陣列檢測器、Empower色譜工作站：美國Waters公司；FW135中藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；BCD-206BD電冰箱：青島海爾有限公司；TE214S分析天平：長沙康源科技開發有限公司；CF-RXⅡ離心機：日本日立公司；pHS-3E pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；SB120D超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

稱取茶葉樣品粉末（過100目篩）約0.2 g，于10 mL容量瓶中，用體積分數為70%的甲醇加至刻度，超聲（40 kHz、120 W）提取30 min，靜置。取上清液過0.45 μm濾膜，取濾液進樣。

1.3.2 標準溶液的制備

稱取阿魏酸對照樣品1 mg于250 mL棕色容量瓶中，用體積分數為70%的甲醇加至刻度，超聲（40 kHz、120 W）提取30 min，靜置。取上清液過0.45 μm濾膜，取濾液進樣。

1.3.3 色譜條件

Shimpack VP-ODS C18（150 mm×6 mm，5 μm）色譜柱，流動相選用0.2%冰醋酸-甲醇（28∶72）[11]，流速1mL/min，檢測波長314 nm，柱溫30℃，進樣量10 μL。

2 結果與分析

2.1 測定條件的選擇

文獻報道中高效液相色譜法測定阿魏酸含量多用體積分數為70%、50%的甲醇、體積分數為70%、50%的乙醇等作為溶劑[11]，樣品制備方法的篩選中，對比了4種溶劑對樣品中阿魏酸的提取，結果用體積分數為70%的甲醇提出的阿魏酸最為完全，因此確定用體積分數為70%的甲醇作溶劑，但因阿魏酸不穩定，容易分解，對照品溶液及樣品溶液配制后，應存放于棕色試劑瓶中避光低溫保存，且須當天配制。阿魏酸對照品溶液在190～400 nm波長范圍內進行紫外光譜掃描，結果表明，阿魏酸在波長314 nm處吸收靈敏度最高，因此選用314 nm為檢測波長。

2.2 阿魏酸標準曲線繪制及含量測定

標品及樣品高效液相色譜圖見圖1。吸取質量濃度分別為20 μg/mL、40 μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL對照品溶液進行色譜測定，按上述色譜條件測定峰面積，以阿魏酸含量（x）對峰面積（y）制作標準曲線見圖2，得回歸方程：y=0.727x+0.019 2，相關系數R2=0.999 8。結果表明，阿魏酸質量濃度在20～100 μg/mL間與峰面積有良好的線性關系[16]。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗

按照樣品測定方法，精密吸取上述阿魏酸標準溶液，重復進樣5次，每次進樣量10 μL，結果（見表1）可知，檢測結果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.46%，＜5%，表明儀器精密度良好[16]。

2.3.2 重復性試驗

精密稱取茶葉樣品（過100目篩）約2.0 g（6份），按1.3.1制備樣品溶液，測定阿魏酸含量，結果見表2。由表2可知，檢測結果RSD為1.67%，＜5%，表明該檢測方法重現性好[16]。

2.3.3 穩定性試驗

精密吸取同一樣品溶液，進樣量10 μL，分別測定阿魏酸的含量，結果見表3。由表3可知，檢測結果RSD為1.59%，＜5%，表明樣品溶液在8 h內穩定。

2.3.4 加樣回收率試驗

取茶葉樣品約0.1 g共6份，于10 mL容量瓶中，加入阿魏酸對照品20 μg，加體積分數為70%的甲醇至刻度，超聲30 min靜置，取上清液過0.45 μm濾膜，取濾液，進樣10 μL，按上述色譜條件測定阿魏酸含量，分別計算回收率，結果見表4。

由表4可知，檢測結果所得平均回收率為98.73%，RSD=1.71%，＜5%，表明該方法準確度高。

2.3.5 樣品提取的條件選擇

稱取樣品茶葉粉末（過100目篩）約0.4 g于10 mL棕色容量瓶中（3份），用體積分數為70%的甲醇稀釋至刻度，分別超聲（40 kHz，120 W）提取10 min、20 min、30 min，靜置。取上清液過0.45 μm濾膜，取濾液，色譜檢測條件下進樣10 μL，檢測阿魏酸含量，結果見表5。

由表5可知，超聲提取10 min未將阿魏酸提取充分，超聲提取20 min較好，與30 min含量沒有明顯變化，因此，選用超聲提取20 min。

2.4 樣品中阿魏酸含量的測定

不同茶廠具有各自獨立的生產線與發酵環境，同一廠家的茶類產品成分大致相近，因此本研究選擇不同茶廠較具代表性的一種發酵型茶葉產品作為研究對象。茯磚茶、青磚茶、普洱茶3種茶葉各選3個不同茶廠生產的產品作為測定的樣品，中藥粉碎機粉碎過100目篩后，備用。每個樣品取2.0 g左右，按1.3.1制備樣品溶液，進樣10 μL，檢測阿魏酸含量，結果見表6。

由表6可知，產于湖南益陽的茯磚茶，阿魏酸含量最高30.286 μg/g，產于云南的普洱茶阿魏酸含量略低為25.762 μg/g，產于湖北的青磚茶阿魏酸含量最低為22.559 μg/g，其含量比湖南益陽的茯磚茶低25.3%，可見不同產地廠家的發酵型茶葉中阿魏酸的含量差異很大，可能是由原料及制備工藝的差異引起的。

3 結論

本試驗確定了發酵型茶葉中阿魏酸的HPLC最佳檢測條件為Shimpack VP-ODS C18色譜柱（150 mm×6 mm，5μm），流動相選用0.2%冰醋酸-甲醇（28∶72）[11]，流速1 mL/min，檢測波長314 nm，柱溫30℃，進樣10 μL。并在上述條件下進行了儀器精密度試驗RSD=1.46%、重復性試驗RSD=1.67%、穩定性試驗RSD=1.59%、加樣回收率試驗RSD=1.71%，均證明試驗的可行性良好。在此基礎上，進行測定各個地區不同廠家發酵型茶的茶葉樣品中阿魏酸的含量，測定結果表明產于湖南益陽的茯磚茶阿魏酸含量最高為30.286 μg/g，不同產地廠家的發酵型茶葉中阿魏酸的含量差異很大，可能是由原料及制備工藝的差異引起的，具體原因有待進一步探討。對不同產地不同差價的發酵型茶葉中阿魏酸的含量進行比較對完善發酵型茶葉的質控體系具有重要意義，茶葉中阿魏酸的具體含量評價標準有待進一步研究。

[1]GREENWALT C J,LEDFORD R A,STEINKRAUS K H.Determination and characterization of the antimicrobial activity of the fermented tea kombucha[J].LWT-Food Sci Technol,1998,31(3):291-296.

[2]ZHANG Z E,YAO S D,LIN W Z,et al.Mechanism of reaction of nitrogen dioxide radical with hydroxycinnamic acid derivatives:a pulse radiolysis study[J].Free Radic Res,1998,21(2):13-16.

[3]周洲，蔣麗媛，張奕華，等.乙酰水楊酰阿魏酸與呋咱氮氧化物和硝酸酯偶聯物的合成及其抗血栓作用[J].醫藥學報，2006，41（11）：1050-1056.

[4]程青芳，王啟發，劉望軍，等.阿魏酸乙酯綠色合成新工藝的研究[J].中國釀造，2009，28（12）：68-69.

[5]HIRABAYASHI T,OCHIAI H,SAKAI S.Inhibitory effect of ferulic acid and isoferulic acid on murine inerleukin-8 production in reponse to influenza infectionsin vitroandin vivo[J].Planta Med,1995,61(3): 221-226.

[6]KAWABATA K,YAMAMOTO T,HARA A,et al.Modifying effects of ferulic acid on azoxymethane-induced colon carcinogenesis in F344 rats [J]. Cancer Lett,2000,157(1):15-21.

[7]李秋怡，干國平，王光忠，等.氣相色譜法測定川芎油中阿魏酸的含量[J].時珍國醫國藥，2007，18（7）：1687-1689.

[8]馮藝戎.TLC法測定安中養血合劑中阿魏酸的含量[J].安徽醫藥，2010，14（6）：654-656.

[9]龔明貴，董娟娥，李進瞳，等.紙色譜分離-紫外分光光度法測定當歸中阿魏酸含量[J].西北農林科技大學學報：自然科學版，2005，33（5）：49-53.

[10]方寶霞，李鵬，時曉亞，等.高效液相色譜法測定生化膏中阿魏酸含量[J].中國藥業，2010，19（3）：30-32.

[11]呂海鵬，林智，谷記平，等.普洱茶中的沒食子酸研究[J].茶業科學，2007，27（2）：104-110.

[12]許暉，孫蘭萍，張斌，等.微生物阿魏酸酯酶的研究進展[J].中國釀造，2008，27（10）：15-20.

[13]吳媛媛，蔣桂華，譚鐳，等.高效液相色譜法測定川滇產亞貢葉中咖啡酸的含量[J].成都中醫藥大學學報，2010，33（3）：76-78.

[14]郭剛軍，龔加順，張新富，等.云南普洱茶中黃酮含量的測定及槲皮素、蘆丁的提取分離[J].食品工業科技，2007，28（3）：67-69.

[15]王妙聞，張藝，張靜，等.HPLC測定川芎中的總阿魏酸[J].華西藥學雜志，2008，23（1）：100.

[16]呂光華，程世瓊，陳金泉，等.HPLC測定川芎藥材和飲片中游離阿魏酸和總阿魏酸的含量及其質量評價指標[J].中國中藥雜志，2010，35（2）：194-198.

CHEN Jin1,HU Maofeng2,WEN Xin3,WU Zhanghua4,LIU Suchun1,5*
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 3.Hunan Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research,Changsha 410128,China; 4.Changsha Seasoning Food Engineering Technology Research Center,Changsha 410000,China; 5.Hunan Key Laboratories of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China)

The ferulic acid contents of fermented tea from different manufacturers were determined by HPLC.The separation was performed on Shimpack VP-ODS C18column(150 mm×6 mm,5 μm)with 0.2%glacial acetic acid-methyl alcohol(28∶72)as mobile phase.Ferulic acid was detected at 314 nm with flowing rate 1.0 ml/min at 30℃.The calibration curve was linear(R2=0.999 8)in the range of 20-100 μg/ml for ferulic acid.The average recovery was 98.73%and relative standard deviation was 1.71%,respectively.The ferulic acid contents of fermented tea from 9 manufacturers were 22.559-30.286 μg/g,and the ferulic acid content in Xiangyi brick tea was the highest of 30.286 μg/g.The method was quick and convenient for ferulic acid determination for fermented tea.

ferulic acid content;fermented tea;HPLC;determination conditions

O657.7

A

0254-5071（2015）04-0161-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.037

2015-03-17

湖南省科技計劃項目（2012NK3072）

陳錦（1989-），女，碩士研究生，研究方向為營養與食品衛生學。

*通訊作者：劉素純（1966-），女，博士，教授，研究方向為營養與食品衛生學。