復合酶水解奶油制備天然奶味香基的工藝研究

張惠丹，汪薇，2*，白衛東，2，何洛強

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州510225；2.廣東省嶺南特色食品工程技術研究中心，廣東廣州510225；3.廣東銘康香精香料有限公司，廣東廣州510000）

復合酶水解奶油制備天然奶味香基的工藝研究

張惠丹1，汪薇1，2*，白衛東1，2，何洛強3

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州510225；2.廣東省嶺南特色食品工程技術研究中心，廣東廣州510225；3.廣東銘康香精香料有限公司，廣東廣州510000）

采用脂肪酶和蛋白酶組成的復合酶制劑作為催化劑，酶解奶油制備天然奶味香基。結果表明，當酶解溫度為40℃，酶解時間7 h，奶油濃度為95%，酶添加量為1.0%，乳清液添加量為25%，脂肪酶A與復合蛋白酶比例為2∶1時，所制得的天然奶味香基為甜奶香型，其香氣自然、柔和、圓潤，此時所產奶味香基的酸價在18～21 mg/g之間，感官評分值可達到70以上。

天然奶味香基；奶油；脂肪酶；復合蛋白酶；酸價

奶味香精是食品工業中應用最為廣泛的香精之一，主要用于糖果、飲料、冷食、焙烤食品等的增香，還可用于飼料的加香，改善飼料的適口性[1-5]。奶味香精對食品風味起著舉足輕重的作用，添加合適的香精，其香氣、口味將會有意想不到的改善，可以給食品原料賦香，矯正食品中的不良氣味，也可以補充食品中原有香氣的不足，穩定和輔助食品中的固有香氣。

酶法制備奶味香基是指以稀奶油、牛奶等為主要原料，通過脂肪酶的作用將脂肪酸（飽和與不飽和的）、甘油三脂、酮酸和羥酸的甘油三酯酶解成飽和及不飽和脂肪酸、酮酸和羥酸，形成多種風味成分的前體物質，經過自然的氧化、斷裂、內酯化等反應產生一系列風味物質。脂肪酸中偶數碳的香氣貢獻較大，羥酸進一步脫水環化生成不同碳數的丙、丁位內酯，尤其是偶數碳丁位內酯，其含量雖少，香氣貢獻卻很大[6-7]。因此以奶油為原料，通過脂肪酶水解作用得到的酶解奶油，再以酶解奶油為基料加以適當修飾，即可得到天然奶味香精[8-14]。本文采用脂肪酶和蛋白酶組成的復合酶制劑作為催化劑，酶解奶油制備甜奶香型天然奶味香基，為天然奶味香基的工業化生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶油：市售；蛋白乳清粉：廣州市日鋒畜牧有限公司；脂肪酶A（lipase A）來源于黑曲霉（Aspergillus niger）、脂肪酶AY（lipase AY）來源于新篩選的皺摺假絲酵母（Candida rugosa）、脂肪酶G（lipase G）來源于青霉（Penicillium camemberti）、脂肪酶R（lipase R）來源于青霉（Penicillum roqueforti）：阿瑪諾天野酶制劑商貿（上海）有限公司；復合蛋白酶：廣東匯香源生物科技有限公司。乙醚、無水乙醇、KOH、酚酞等均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

THC-C恒溫振蕩器：太倉市試驗設備廠；JJ500精密電子天平：上海精勝科學儀器有限公司；HH數顯恒溫水浴鍋：金壇市金成國勝試驗儀器廠；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳清液的配制

稱取一定量的乳清粉，再用乳清粉質量3倍的水溶解，混合均勻待用。

1.3.2 酶解工藝流程及操作要點

酶解工藝流程如下：

稱取奶油→添加水和乳清液→85℃巴氏滅菌5 min→降溫至30～45℃→添加脂肪酶和復合蛋白酶→于設定溫度（35～45℃）下水解一定時間→85℃滅酶30 min→酸價測定→香氣評分

操作要點：將無水奶油溶解之后，與適量乳清液按一定比例加入具塞三角瓶中攪拌均勻，于85℃進行預殺菌。降溫至30～45℃之后，加入脂肪酶和復合蛋白酶，置于恒溫振蕩器中在180 r/min的條件下進行酶解，反應一段時間后，將三角瓶置于恒溫水浴鍋中開始滅酶（85℃、30 min）。酶解過后對產生的香氣進行香氣評分，并取其上清液測定酸價。

1.3.3 脂肪酶的篩選

在4個50 mL具塞三角瓶中分別加入12 g奶油，添加水至15 g，然后分別添加奶油質量的1%的不同的脂肪酶（lipase A、lipase G、lipase R、lipase AY），置于恒溫氣浴振蕩器中開始反應（40℃、180 r/min），酶解4 h后置于恒溫水浴鍋中開始滅酶（85℃、30 min），滅酶過后對產生的香氣進行感官評價，并取其上清液測定酸價。

1.3.4 不同因素對酶解奶油產香的影響

（1）溫度對酶解奶油產香的影響

在5個50 mL具塞三角瓶中分別加入12 g奶油，添加水至15 g，然后分別添加奶油質量的1%的酶量（脂肪酶與復合蛋白酶比例為2∶1），置于不同溫度的恒溫氣浴振蕩器中開始反應，溫度設置為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，轉速180 r/min，酶解4 h后置于恒溫水浴鍋中開始滅酶（85℃、30 min），滅酶過后對產生的香氣進行感官評價，并取其上清液測定酸價。

（2）奶油濃度對酶解奶油產香的影響

在6個50mL具塞三角瓶中分別加入7.5g、12.0g、13.5 g、14.3 g、14.7 g、15.0 g的奶油，添加水至15 g，所配制得奶油質量分數分別為50%、80%、90%、95%、98%和100%。然后分別添加為奶油質量的1%的酶量（脂肪酶與復合蛋白酶比例為2∶1），置于恒溫氣浴振蕩器中開始反應（40℃、180 r/min），酶解4 h后置于恒溫水浴鍋中開始滅酶（85℃、30 min），滅酶過后對產生的香氣進行感官評價，并取其上清液測定酸價。

（3）輔助底物對酶解奶油產香的影響

在2個50 mL具塞三角瓶中分別加入14.3 g奶油，添加水至15 g，分別添加乳清液與脫脂奶粉3.6 g，然后各添加奶油質量1%的酶量（脂肪酶與復合蛋白酶比例為2∶1），置于恒溫氣浴振蕩器中開始反應（40℃、180 r/min），酶解4 h后置于恒溫水浴鍋中開始滅酶（85℃、30 min），滅酶過后對產生的香氣進行感官評價，并取其上清液測定酸價。

（4）乳清液添加量對酶解奶油產香的影響

在6個50 mL具塞三角瓶中分別加入奶油14.3 g，水0.7 g，乳清液1.2 g、1.4 g、2.4 g、3.6 g、5.0 g、7.1 g，即乳清液添加量分別為8.4%、9.8%、16.8%、25%、35%、50%，然后各添加奶油質量1%的酶量（脂肪酶與復合蛋白酶比例為2∶1），置于恒溫氣浴振蕩器中開始反應（40℃、180 r/min），酶解4 h后置于恒溫水浴鍋中開始滅酶（85℃、30 min），滅酶過后對產生的香氣進行感官評價，并取其上清液測定酸價。

（5）總酶量對酶解奶油產香的影響

在6個50 mL具塞三角瓶中分別加入奶油14.3 g、水0.7g、乳清液3.6 g，然后分別添加為奶油質量的0.5%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%的酶量（脂肪酶與復合蛋白酶比例為2∶1），置于恒溫氣浴振蕩器中開始反應（40℃、180 r/min），酶解4 h后置于恒溫水浴鍋中開始滅酶（85℃、30 min），滅酶過后對產生的香氣進行感官評價，并取其上清液測定酸價。

（6）脂肪酶和復合蛋白酶比例對酶解奶油產香的影響

在6個50 mL具塞三角瓶中分別加入奶油14.3 g、水0.7 g、乳清液3.6 g，總酶量為奶油的1%（脂肪酶與復合蛋白酶比例分別為1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1），置于恒溫氣浴振蕩器中開始反應（40℃、180 r/min），酶解4 h后置于恒溫水浴鍋中開始滅酶（85℃、30 min），滅酶過后對產生的香氣進行感官評價，并取其上清液測定酸價。

（7）酶解時間對酶解奶油產香的影響

在6個50 mL具塞三角瓶中分別加入奶油14.3 g、水0.7 g、乳清液3.6 g、然后各添加奶油質量1%的酶量（脂肪酶與復合蛋白酶比例為2∶1），置于恒溫氣浴振蕩器中開始反應（40℃、180 r/min），分別酶解4 h、6 h、7 h、8 h、13 h后置于恒溫水浴鍋中開始滅酶（85℃、30 min），滅酶過后對產生的香氣進行感官評價，并取其上清液測定酸價。

1.3.5 酸價測定

酸價（以脂肪計）測定方法參考GB/T 5530—2005《動植物油脂酸值和酸度測定》。

1.3.6 感官評價

由5位感官評價成員，根據各自的喜好對發酵所得奶味香精的香氣進行香氣強度、香氣協調性、留香3個方面的評價，滿分100分，具體的評分標準見表1。

2 結果與分析

2.1 脂肪酶的篩選

選擇4種脂肪酶lipase A、lipase G、lipase R、lipase AY水解奶油制備天然奶味香基。lipase A主要作用于α位。lipase AY水解甘油三酯的1、2和3位置形成短鏈、中鏈和長鏈脂肪酸。lipase G主要作用于甘油單酯、甘油二酯，游離出脂肪酸。lipase R主要作用于甘油三酯的α位。除長鏈外，更能游離出中鏈、短鏈脂肪酸。

不同微生物來源的脂肪酶由于酶活中心結構的差異，水解相同的甘油三酯所表現出的脂肪酸特異性不同。奶味香氣主要是由低級脂肪酸、羰基化合物以及極微量的揮發性成分組成。中短鏈脂肪酸對奶味香氣直接貢獻較大，是構成奶香的直接因素[15]。另外，酶活性越強，酶解就越充分，所得風味物質就越豐富，不同脂肪酶對酶解奶油產香的影響見表2。由表2可知，lipase A活力較其他三個大，且酶解奶油產生的香型是甜香型。選擇lipase A為催化劑，酶解奶油制備甜香型天然奶味香基。

2.2 溫度對酶解奶油產香的影響

酶類對溫度比較敏感，溫度過高會使脂肪酶變性失活；溫度過低會抑制酶的活性，同時也會影響底物的黏度，從而影響傳質速度。溫度對酶解奶油產香的影響結果見表3。

由表3可知，當溫度低于40℃時，隨著溫度的升高，酸價和香氣評分呈現上升的趨勢，隨著酶活性的增強，香氣濃度也隨之增加；當溫度高于40℃時，隨著溫度的增加，令人不悅的酸臭味加重，奶香變淡。綜合考慮，最適的酶解溫度選擇40℃為宜。

2.3 奶油含量對酶解奶油產香的影響

適量的水能促進酶反應，而過量的水會使酶反應速度下降，導致酶解奶油產香效果變差。奶油含量越大，酶解產生的風味物質就越多越豐富，但當奶油含量過大時，就可能產生一些不需要的風味物質，使得所產奶味香基香氣不協調，帶有異味（如酸味）等。奶油含量對酶解奶油產香的影響見表4。

由表4可知，當奶油含量＜95%時，奶油含量越高，香氣強度越大，且酸價也有上升的趨勢；當奶油含量達到95%時，所得奶味香基為濃郁、圓潤，回味悠長的香甜型奶味，此時測得所產奶味香基的酸價為18.7 mg/g；當奶油濃度＞95%時，產香效果開始變差，所得奶味香基均帶有酸味，酸價仍然呈上升趨勢。綜合考慮，最適的奶油含量選擇95%為宜。

2.4 輔助底物對酶解奶油產香的影響

以純奶油為底物水解后產物的香氣較為單一，通過添加輔助底物可以使產物的香氣更加豐富。不同輔助底物水解產物的香氣評分如表5。

由表5可知，輔助底物為乳清液的香氣最為柔和純正，產品的風格豐富。因此，選用乳清液為輔助底物。

2.5 乳清液添加量對酶解奶油產香的影響

乳清液的添加使得酶解底物更加豐富、柔和，具有修飾奶味香基風味的作用，并且使所得奶味香基的口感更加細膩香滑。乳清液添加量對酶解奶油產香的影響見表6。

由表6可知，當乳清液添加量＜3.6 g時，隨著乳清液添加量的增加，感官評價的分數也越高；當乳清液添加量達到3.6 g時，所得奶味香基為濃郁、圓潤，回味悠長的香甜型奶味，此時測得所產奶味香基酸價為19.2 mg/g；當乳清液添加量＞3.6 g時，隨著乳清液含量的增加，產香效果越差，焦糖味加重，所得奶味香基的酸價也隨之呈上升趨勢。綜合考慮，最適的乳清液添加量選擇3.6 g即25%為宜。

2.6 總酶量對酶解奶油產香的影響

酶催化生成奶味香基時，其用量對香基的風味有較大影響。酶用量少時，風味物質生成量少，奶味較淡；用量過多，雖然可以產生大量的風味物質，但會引起其它不良現象的產生，如產生異味等，再者也會增加生產成本。酶添加量對酶解奶油產香影響的結果見表7。

由表7可知，當總酶量＜1.0%時，隨著總酶量的增大，產香效果越好，香氣越濃郁，上清液顏色越深且清澈；當總酶量為1.0%時，所得奶味香基為濃郁、圓潤且回味悠長的香甜型奶味，此時測得所產奶味香基酸價為19.7 mg/g；當總酶量＞1.0%時，所得奶味香基開始出現酸敗味，且隨著總酶量的增大，酸敗味越嚴重，酸價亦呈上升趨勢。綜合考慮，最適的總酶量選擇1.0%為宜。

2.7 脂肪酶和復合蛋白酶比例對酶解奶油產香的影響

隨著脂肪酶比例的增加，酶解奶油產生的風味底物就越多越豐富，原來的清淡奶香味變成濃郁香醇的奶香味。復合蛋白酶可同時對多種蛋白質進行水解，使酶解后產生的奶味香基風味得到修飾，口感更加細膩香滑。脂肪酶和復合蛋白酶比例對酶解奶油產香的影響結果見表8。

由表8可知，當脂肪酶A與復合蛋白酶比例＜2∶1時，隨著脂肪酶A添加量的增大，所得奶味香基的香氣強度也隨之加強，酸價呈上升趨勢；當脂肪酶A與復合蛋白酶比例為2∶1時，所得奶味香基的香氣最濃郁，奶香味與甜味協調，自然且留香時間久，此時測得所產奶味香基的酸價為20.6 mg/g；當脂肪酶A與復合蛋白酶比例＜2∶1時，隨著脂肪酶A添加量的增大，所得奶味香基的風味就越不協調，且酸敗味加重，酸價仍然呈上升趨勢。綜合考慮，最適的脂肪酶A與復合蛋白酶比例為2∶1。

2.8 酶解時間對酶解奶油產香的影響

從理論上說，酶解時間越長，酶解就越徹底，實際上，過長的反應時間可能會造成不良風味物質的生成增多，影響香基的整體風味，但如果作用時間過短，使得反應程度不足，風味物質生成太少，風味沒有充分形成，所以要達到理想的風味，反應時間應控制好。酶解時間對酶解奶油產香的影響結果（表9）可知，當酶解時間＜7 h時，酶解時間越長，所得奶味香基的香氣就越濃郁，酸價隨之呈上升趨勢；當酶解時間為7 h時，產香效果達到最好，所得奶味香基呈現出濃郁、圓潤的奶香氣，并與奶甜味協調，留香時間長，此時測得所產奶味香基的酸價為21.0 mg/g；酶解時間＞7 h時，開始出現酸敗味，且隨著酶解時間的加長，酸敗味也隨之加重，酸價呈上升趨勢。綜合考慮，最適的酶解時間選擇7 h為宜。

3 結論

復合酶制備天然奶味香基的最適脂肪酶為lipase A，最適酶解溫度為40℃，最適奶油濃度為95%，最適輔助底物為乳清液，最適乳清液添加量為25%，最適總酶量為1.0%，最適脂肪酶與復合蛋白酶比例為2∶1，最適酶解時間為7 h。在該最佳反應條件下，所產生的奶香風味香甜、濃郁、圓潤、柔和，此時所產奶味香基的酸價在18～21 mg/g之間，感官評分值可達到70以上。

[1]艾娜絲，王靜，張曉梅，等.奶香型香味料的制備及分析技術研究進展[J].食品工業科技，2014（21）：380-384.

[2]ASHURST P R.食品香精的化學與工藝學[M].北京：中國輕工業出版社，2005.

[3]宋煥祿.食品風味化學[M].北京：化學工業出版社，2008.

[4]汪薇，白衛東，趙文紅.生物法制備奶味香精的研究進展[J].中國調味品，2009（4）：27-30.

[5]汪薇，白衛東，趙文紅.生物技術在天然香精香料生產中的應用[J].中國釀造，2009，28（9）：7-10.

[6]張之滌.酶法奶類香精的研制及其應用[J].中國食品添加劑，1999（4）：51-53.

[7]胡文效，姜興濤.乳類食品香成分及其成因[J].山東食品發酵，2001（4）：36-38.

[8]劉曉艷，成堅，徐曉飛.非水體系脂肪酶催化生成奶味香精的研究[J].食品工業科技，2007，28（4）：191-193.

[9]王永華，楊博，黃海浪，等.酶解油脂生產天然奶味香精基料的方法：中國，CN1907123A[P].2007.

[10]汪薇，趙文紅，白衛東，等.乳酸菌發酵制備天然奶味香精的研究[J].食品與發酵工業，2010（10）：195-199.

[11]劉敏堯，張軍，劉靚，等.一種利用復合酶制劑制備奶味香精的方法：中國，CN1857112[P].2006.

[12]汪建明，李秉業，馬鳳艷.奶酪風味劑的研究與開發[J].中國食品添加劑，2008（S1）：171-177.

[13]穆海菠，黃漢榮，羅昌榮，等.一種以酶水解奶油為原料氧化熱裂解為增香型奶香料的方法：中國，CN101099560[P].2008.

[14]黃漢榮，羅昌榮，陳玉銘，等.一種以奶油為原料生物轉化成乳化型奶香料的方法：中國，CN101099561[P].2008.

[15]宋煥祿.食用香味料的生化生物制備[M].北京：中國物資出版社，2002.

ZHANG Huidan1,WANG Wei1,2*,BAI Weidong1,2,HE Luoqiang3
(1.Light Industry Institute of Food,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China; 2.Guangdong Engineering Technology Research Center for Lingnan Specialty Food,Guangzhou 510225,China; 3.Guangdong Wincom Flavors&Fragrances Co.,Ltd.,Guangzhou 510000,China)

The natural milky flavor was prepared from cream hydrolyzed by compound enzyme of lipase and protease.Results showed that the optimal reaction temperature,time,cream concentration,compound enzyme addition,whey solution addition,lipase A and protease ratio were 40℃,7 h, 95%,1.0%,25%,2∶1,respectively.The flavor of the prepared natural milky flavor was sweet milky.The acid value was between 18-21 mg/g and the sensory evaluation score of the milky flavor reached over 70.

natural milky flavor;cream;lipase;compound protease;acid value

TS202.3

A

0254-5071（2015）04-0141-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.032

2015-03-20

仲愷農業工程學院——廣東銘康香精香料有限公司橫向課題（D1141433）

張惠丹（1991-），女，本科生，研究方向為食品生物技術。

*通訊作者：汪薇（1981-），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。