抗菌肽的功能及生產研究進展

劉倫倫，劉 焱1， *，瞿朝霞，羅 燦

（1.湖南農業大學 食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學 食品科技學院，湖南 長沙 410128）

抗菌肽（antibacterial peptides，ABP）是具有抗菌活性的肽類的總稱，抗菌肽不但具有廣譜的抗菌活性，而且還有抗癌、抗病毒、抗寄生蟲、促進傷口愈合等作用，具有較大的藥用開發價值。天然抗菌肽通常是由12～100多個氨基酸殘基組成的堿性小分子多肽，水溶性好，有典型的兩親結構，分子質量大約4～10 ku。在近幾年中，抗菌肽逐漸成為免疫學、細胞生物學和分子生物學等領域的研究熱點，有望開發為新一代肽類抗菌、抗癌等藥物的來源。因此，為更好地了解抗菌肽的研究進展和促進抗菌肽的生產應用，本文對抗菌肽的功能，純化鑒定方法，人工合成和基因工程表達進行了綜述，以期為抗菌肽的純化鑒定、生產和應用提供理論依據。

1 抗菌肽的功能及作用機理

1.1 抗菌肽的抗菌功能

抗菌肽具有廣譜的抗菌活性，大部分抗菌肽能夠抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌生長，其中還有一些具有抗真菌的效果。DE LATOUR F A等[1]從眼鏡蛇中提取的抗菌肽對大腸桿菌（Escherichia coli）具有抑菌活性；DOSLER S等[2]研究表明抗菌肽對綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）的抗菌效果顯著且能抑制綠膿桿菌生物膜的形成，相比抗生素不易產生耐藥性，不同抗菌肽之間以及抗菌肽和抗生素可通過協同作用，提高抗菌效果。HWANG B等[3]從柑橘鳳蝶中提取的柑橘鳳蝶抗菌肽（papiliocin）通過調節活性氧和羥自由基的積累控制白色念珠菌（Candida albicans）的凋亡。OUELLET M等[4]研究了分別由14個氨基酸和21個氨基酸組成的具有兩親性的合成抗菌肽，這兩種抗菌肽都含有亮氨酸和苯丙氨酸，但作用機理有所不同，由14個氨基酸組成的抗菌肽充當細胞膜擾亂器的角色，引發鈣離子和鈉離子等的泄漏，而由21個氨基酸組成的抗菌肽主要是作為離子通道，且酰基鏈的長度和序列對抗菌活性都有影響。可以看出，不同抗菌肽的抗菌作用方式并不完全相同。到目前為止，抗菌肽的抗菌機理還不是很明確，主要被接受的理論是抗菌肽在靜電作用下吸附到病原微生物細胞膜的表面，改變了細胞膜的結構，使得細胞內容物泄漏出來，從而起到了殺菌作用。

1.2 抗菌肽的抗癌功能

抗菌肽除了能抑制病原微生物生長外，其抗癌活性也是研究的一個重點。CHEN H M等[5]合成的肽CA，CB，CB-1和CB-2不僅對大腸桿菌（E.coli）、肺炎桿菌（pneumobacillus）和綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）有抗菌活性，且CB-1和CB-2對HL-60血癌細胞（HL-60 leukemia）的抑制作用明顯。RIEDL S等[6]報道陽離子型抗菌肽能通過與細胞上帶陰電荷的成分作用（磷脂酰絲氨酸、唾液酸等）識別腫瘤細胞和非腫瘤細胞，而且腫瘤細胞上的微絨毛也能提高陽離子型抗菌肽的識別能力，抗癌作用主要體現在穿透目標細胞并破壞其細胞膜的完整性，在活體生物試驗中，陽離子型抗菌肽對血癌、前列腺癌、卵巢癌等癌細胞具有抗癌活性。LIN M C等[7]通過酶聯免疫吸附試驗和蛋白印跡試驗方法發現從蝦中提取的一種抗菌肽（抗脂多糖因子）經抑制p38絲裂原活化蛋白激酶的激活和核轉錄因子的表達的途徑來抑制宮頸癌細胞分泌前炎性細胞活素。抗菌肽作用于腫瘤細胞，卻對正常細胞沒有毒害作用，這是非常重要的一點。但基于目前此類研究多集中在體外試驗，相關基礎研究的理論依據還不夠充實，因此還需進一步研究。

1.3 抗菌肽的其他功能

抗菌肽不僅具有廣譜抗菌活性，且某些抗菌肽還有抗病毒活性，如哺乳動物的防御素和兩棲動物皮膚中提取的抗菌素。將美洲大蠊醇提物純化制成的藥物對燒傷、燙傷等外傷有較好的修復作用，目前已有多種臨床用途。據BARONI A等[8]的報道，蛙皮素也可能參與傷口的皮膚修復。α-螺旋抗菌肽除了具有抗菌等有益的活性外，也可能具有溶血活性等對機體的其他細胞毒性，POLYANSKY A A等[9]研究表明，α-螺旋抗菌肽的溶血活性與其N末端具有高度疏水性相關，因此可通過在不影響抗菌活性的前提下適當調整N末端結構，減少其溶血活性。

2 抗菌肽的生產

2.1 天然抗菌肽的分離純化

2.1.1 原料的選擇和預處理

提取首先考慮的是樣品的選擇和預處理的方法。根據大量的研究資料，抗菌肽在很多生物體內廣泛存在，且在不同的生物中存在的部位也不一致，如哺乳動物的血液和腸道，兩棲動物的皮膚，魚的皮膚黏液、鰓和腸道，節肢動物的腔體，軟體動物的黏液和血淋巴，植物分泌液，微生物的次級代謝產物等能分離得到抗菌物質；對于一些生物，抗菌肽自然存在于生物體內，而在另一些生物中則需要誘導產生，如從昆蟲中提取抗菌肽，多數需要刺激，包括機械刺激，菌誘導刺激。

2.1.2 抗菌肽分離純化

抗菌肽一般的的分離純化步驟包括：a.溶劑提取或沉淀：包括用離心或超濾除去雜物；b.純化預處理：如排阻色譜（凝膠滲透色譜法和凝膠層析法）、離子交換層析、固相萃取等，除去鹽、陰離子的蛋白質、脂肪物質和其他干擾物質；c.分析型分離：用反相高效液相色譜分離純化得到具有抗菌活性的肽。

（1）酸提法

乙酸是常用的溶劑，OVCHINNIKOVA T V等[10]用體積分數為10%乙酸勻漿海洋底棲多毛類生物海蚯蚓（Arenicola marina），提取液4 ℃條件下25 000×g離心2 h，離心后上清液經YM-10過濾器超濾，制備性連續酸性尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳（continuous acid urea-polyacrylamide gel electrophoresis，CAU-PAGE）和反相液相色譜（reversed phase liquid chromatography，RPLC）分離出兩種亞型分子質量為2 758.3 u的海蚯蚓抗菌肽-1（arenicin-1）和分子質量為2 772.3 u的海蚯蚓抗菌肽-2（arenicin-2），對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌有抗菌活性，其氨基酸序列為RWCVYAYVRVRGVLVRYRRCW和RWCVYAYVRIRGVLVRYRRCW，且含半胱氨酸。CHARLET M等[11]用乙酸從貽貝中提取抗菌肽貽貝屬防御素（mytilus defensins），貽貝抗菌肽（mytilins），貽貝抗真菌肽（mytimycin）。

（2）有機溶劑提取法

韓俊友[12]用體積分數80%的甲醇溶液浸提牛蛙的皮膚，12 000 r/min 離心20 min，揮發甲醇，用Sephadex G-50凝膠層析，經反相液相色譜純化得到2種抑菌活性肽；LI C等[13]用含0.1%三氟乙酸的體積分數60%乙腈浸提綠海膽（Strongylocentrotus droebachiensis），經反相液相色譜純化提取到了對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有抗菌活性的陽離子肽，分子質量4.5 ku的centrocins 1和分子質量4.4 ku的centrocins 2。KONNO K等[14]用含0.1%三氟乙酸的乙腈∶水=1∶1（V/V）的溶液從蛛蜂（Anoplius samariensis）的蜂毒中提取到了抗菌肽。STENSV?G K等[15]用同樣用含0.1%三氟乙酸的體積分數60%乙腈浸提蜘蛛蟹血細胞，經反相液相色譜純化提取到了由37個氨基酸組成抗菌肽，其N末端結構域富含脯氨酸和精氨酸，C末端結構域含兩個雙硫鍵。

（3）硫酸銨沉淀法

LóPEZ-ABARRATEGUI C 等[16]用 含0.1% HCl 的0.6 mol/L NaCl與海螺（Cenchritis muricatus）（2∶1）勻漿，提取液4 ℃條件下10 000×g離心30 min，上清液4 ℃條件下用飽和度為100%的硫酸銨溶液攪拌1 h，得到沉淀物，10 000×g離心30 min，沉淀用pH 8.0的10 mmol/L Tris-HCl復溶并脫鹽，再用Amicon Ultra-15 超濾離心管截留分子質量＞10 ku的物質，溶液經反相液相色譜純化得到抑菌活性肽。

（4）離心沉淀法

DOLASHKA-ANGELOVA P 等[17]將 海 螺（Rapana venosa）的血淋巴先于4 ℃條件下5 000×g離心30 min，除去細胞內容物，再于4 ℃條件下30 000×g離心4 h，除去血藍蛋白，上清液分別用截留分子質量3 ku、10 ku和30 ku的微孔濾膜過濾，分子質量在3～10 ku的濾液經反相液相色譜純化得到抗菌肽。王雪鵬等[18]直接用注射器從貝類體內采集血淋巴，在4 ℃條件下5 000 r/min離心10 min，取上清液，經0.22 μm孔徑無菌過濾器過濾，得到的物質對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（E.coli）、白色念珠菌（Candida albicans）有抑制作用。

雖然，從生物體中分離純化抗菌肽的方法較多，但是，都需要注意的是要保持其抗菌活性，如大部分抗菌肽是陽離子肽，在酸性條件下穩定性較高；且因為它是肽類物質，還應避免發生不可逆性變性。

2.2 抗菌肽的結構分析

2.2.1 一級結構分析

抗菌肽的結構分析包括肽鏈的末端分析，氨基酸組成和序列分析，二硫鍵定位和肽段的排序，輔助因子的定位等。分析N端殘基或C端殘基來確定不同肽鏈的數量，但N端的氨基和C端的羧基被封閉，或肽鏈為環肽，分析的難度會增大。N端可采用化學方法（如丹磺酰氯與N端反應生成的丹磺酰基氨基酸進行色譜法檢測）和酶法分析。肽鏈的序列分析之前需要進行氨基酸組成，氨基酸組成分析可使用氨基酸自動分析儀。肽的梯度測序法、質譜法和Edman降解法分析肽鏈的序列是比較有效的方法。

一級結構的分析有利于將不同生物體或同種生物體的不同抗菌肽進行歸類，且有利于研究抗菌肽的抗菌機理。王三山等[19]將12種抗菌肽的氨基酸序列進行分析，不變的氨基酸有Lys6、Gln9、Gly12和Arg16，稱為一級保守氨基酸，不同的氨基酸有特定的作用，如堿性氨基酸，與細菌膜的酸性磷脂作用可能相關，Trp2和Lys6處于兩親性螺親水面的中心部分，對抗菌肽的活性非常重要，C端疏水氨基酸較多可能與穿膜作用相關。

2.2.2 二級結構分析

抗菌肽的二級結構單元大多數由多重氫鍵穩定，因此穩定性較高，規則的二級結構主要有螺旋（最常見的是α-螺旋）、β-折疊、環形及伸展結構。無論抗菌肽是以α-螺旋、β-折疊還是環形形式出現，兩親結構（具有兩個表面，一個親水、一個疏水）是其共同特征。圓二色譜是快速確定二級結構的方法，α-螺旋構象的特征是一般在222 nm和208 nm處出現負帶，在192 nm處出現正帶；β-折疊在216 nm出現負帶，在接近195 nm有一正帶；不規則構象在200 nm以下有一強負帶。此外，黃金豐[20]通過圓二色譜分析，發現多肽分子在進入細胞膜的疏水環境中，也將被誘導為螺旋結構，且多肽中心位置的氨基酸替換對多肽的二級結構影響更大。傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）主要用于估計二級結構元素的含量。周杰等[21]利用傅里葉變換紅外光譜等方法分析出一種中國林蛙抗菌肽的主要組成是酪氨酸，天冬酰胺（天冬氨酸）和谷氨酸（谷氨酰胺）。二維核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）光譜也是現在較廣泛的結構分析技術之一。夏順霞[22]對S24多肽的二維核磁共振光譜研究表明，其在水中應該是以無規則卷曲的結構存在的。

2.3 抗菌肽的合成

抗菌肽的人工合成，基于對抗菌肽結構的了解。目前抗菌肽的結構分類基本是：線性抗菌肽，包括α-螺旋型，β-折疊型，富含脯氨酸、精氨酸、亮氨酸和甘氨酸或組氨酸樣抗菌肽等；含分子內二硫鍵的環狀抗菌肽；多亞基抗菌肽。

基于大部分抗菌肽的特征，合成的抗菌肽一般帶陽離子，具有兩親性（螺旋輪法），氨基酸的替換在不改變兩親性的前提下進行，結構簡化，可截取天然抗菌肽的部分組合形成雜合肽[24-25]。

李國棟等[26]通過固相合成多肽的方法用一個鉸鏈結構甘氨酸-異亮氨酸-甘氨酸（glycine -isoleucine-glycine，GIG）將抗菌肽cecropin A1的N端1-8序列KWKLFKKI和一段α-螺旋結構序列相連，合成的抗菌肽抗菌活性提高了100倍。CHEN H M等[5]用肽合成儀合成肽CA，CB，CB-1和CB-2，再用樹脂，凝膠層析，反相液相色譜分離純化，純度達95%。肽CA的抗菌活性低于CB，CB-1和CB-2。CB-1和CB-2對HL-60血癌細胞（HL-60 leukemia）的抑制作用優于CB。SHIN S H等[27]將富含亮氨酸的紅海鞘抗菌肽HG1（具有廣譜抗菌活性，但在人的血清中抗菌活性不高）替換兩個氨基酸殘基，新的異構紅海鞘抗菌肽（haloganan）在人的血清和傷口的液體中抗菌活性高。

2.4 抗菌肽的基因工程表達

抗菌肽在生物活體中含量少，分離純化困難且也存在一些安全性問題，人工化學合成抗菌肽的成本高，因此，研究抗菌肽的基因工程表達，有利于降低抗菌肽的生產成本和去除不期望的生理活性，擴大抗菌肽的應用價值[28]。

抗菌肽的基因工程表達一般包括三個重要內容：抗菌肽的基因結構分析，抗菌肽的基因表達調控及互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，Cdna）編碼，抗菌肽的基因表達系統。相關研究者通過融合蛋白的方法將抗菌肽的基因在大腸桿菌（E.coli）中表達，巴氏畢赤酵母表達系統相對優于大腸桿菌表達系統，其應用越來越廣泛。張果蘋等[29]克隆了背角無齒蚌抗菌肽（theromacin）基因的cDNA 全序列，其編碼的抗菌肽的氨基酸序列與背角無齒蚌抗菌肽（theromacin）的氨基酸序列相似度達73%，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chainreaction，PCR）分析，發現該基因在外套膜的表達中最高。冷明壘[30]通過構建重組質粒，將蒼蠅抗菌肽SK84在大腸桿菌（E.coli）中表達，表達的抗菌肽對蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）有一定的抗菌活性。

3 展望

抗菌肽在生物體中的含量極微，提取成本較高；抗菌肽的化學合成比較困難，基因工程雖是生產抗菌肽的可行方法，但是在微生物中直接表達抗菌肽基因，可能會造成宿主微生物死亡而不能獲得表達產物，以融合蛋白的方式表達抗菌肽基因，則有表達效率低的問題等。除生產環節存在困難外，分離純化也存在產品純度不高，抗菌肽穩定性較差等問題。在應用方面，抗菌肽的藥理、藥效、毒理方面的研究，還沒形成具體的理論體系，需做進一步的研究。

[1]DE LATOUR F A,AMER L S,PAPANSTASIOU E A,et al.Antimicrobial activity of theNaja atracathelicidin and related small peptides[J].Biochem Bioph Res Co,2010,396(4):825-830.

[2]DOSLER S,KARAASLAN E.Inhibition and destruction ofPseudomonas aeruginosabiofilms by antibiotics and antimicrobial peptides[J].Peptides,2014,62(7):32-37.

[3]HWANG B,HWANG J S,LEE J,et al.Induction of yeast apoptosis by an antimicrobial peptide,papiliocin[J].Biochem Bioph Res Co,2011,408(1):89-93.

[4]OUELLET M,OTIS F,VOYER N,et al.Biophysical studies of the interactions between 14-mer and 21-mer model amphipathic peptides and membranes:Insights on their modes of action[J].BBA-Biomembranes,2006,1758(9):1235-1244.

[5]CHEN H M,WANG W,SMITH D,et al.Effects of the anti-bacterial peptide cecropin B and its analogs,cecropins B-1 and B-2,on liposomes,bacteria,and cancer cells[J].BBA-Gen Subjects,1997,1336(2):171-179.

[6]RIEDL S,ZWEYTICK D,LOHNER K.Membrane-active host defense peptides-challenges and perspectives for the development of novel anticancer drugs[J].Chem Phys Lipids,2011,164(8):766-781.

[7]LIN M C,HUI C F,CHEN J Y,et al.The antimicrobial peptide,shrimp anti-lipopolysaccharide factor(SALF),inhibits proinflammatory cytokine expressions through the MAPK and NF-κB pathways inTrichomonas vaginalisadherent to HeLa cells[J].Peptides,2012,38(2):197-207.

[8]BARONI A,PERFETTO B,CANOZO N,et al.Bombesin:a possible role in wound repair[J].Peptides,2008,29(7):1157-1166.

[9]POLYANSKY A A,VASSILEVSKI A A,VOLYNSKY P E,et al.N-terminal amphipathic helix as a trigger of hemolytic activity in antimicrobial peptides:a case study in latarcins[J].FEBS Lett,2009,583(14):2425-2428.

[10]OVCHINNIKOVA T V,ALESHINA G M,BALANDIN S V,et al.Purification and primary structure of two isoforms of arenicin,a novel an-timicrobial peptide from marine polychaetaArenicola marina[J].FEBS Lett,2004,577(1):209-214.

[11]CHARLET M,CHERNYSH S,PHILIPPE H,et al.Innate immunity isolation of several cysteine-rich antimicrobial peptides from the blood of a mollusc,Mytilus edulis[J].J Biol Chem,1996,271(36):21808-21813.

[12]韓俊友.牛蛙皮膚抗菌肽分離純化、基因克隆表達及生物學特性的研究[D].吉林：吉林大學博士論文，2007.

[13]LI C,HAUG T,MOE M K,et al.Centrocins:isolation and characterization of novel dimeric antimicrobial peptides from the green sea urchin,Strongylocentrotus droebachiensis[J].Dev Comp Immunol,2010,34(9):959-968.

[14]KONNO K,HISADA M,FONTANA R,et al.Anoplin,a novel antimicrobial peptide from the venom of the solitary waspAnoplius samariensis[J].BBA-Protein Struct M,2001,1550(1):70-80.

[15]STENSV?G K,HAUG T,SPERSTAD S V,et al.Arasin 1,a proline-arginine-rich antimicrobial peptide isolated from the spider crab,Hyas araneus[J].Dev Comp Immunol,2008,32(3):275-285.

[16]LóPEZ-ABARRATEGUI C,ALBA A,SILVA O N,et al.Functional characterization of a synthetic hydrophilic antifungal peptide derived from the marine snailCenchritis muricatus[J].Biochimie,2012,94(4):968-974.

[17]DOLASHKA-ANGELOVA P,SCHWARZ H,DOLASHKI A,et al.Oligomeric stability ofRapana venosahemocyanin(RvH)and its structural subunits[J].BBA-Proteins Proteom,2003,1646(1):77-85.

[18]王雪鵬，張 鑫，張 玲，等.泥蚶血淋巴抗菌活性分析[J].山東畜牧獸醫，2012，32（12）：1-2.

[19]王三山，徐 梅，甘人寶，等.抗菌肽的一級結構和二級結構分析[J].動物學研究，1993，14（增刊）：120-127.

[20]黃金豐.α-螺旋型膜活性多肽對不同細胞膜的構效關系及作用機理研究[D].吉林：吉林大學博士論文，2011.

[21]周 杰，孟慶繁，田曉樂，等.一種中國林蛙抗菌肽的光譜研究[J].高等學校化學學報，2007，28（6）：1064-1068.

[22]夏順霞.核磁共振技術在有機化合物和多肽分子結構和功能研究中的應用[D].武漢：華中師范大學碩士論文，2008.

[23]宋敬敬.應用核磁共振技術研究吡啶并[4，3-d]嘧啶類化合物和抗菌肽Phylloseptin-l 的結構[D].武漢：華中師范大學碩士論文，2012.

[24]尹 佳.雜合抗菌肽MgJ 基因真核表達載體的構建[J].中國釀造，2013，32（8）：88-90.

[25]尹 佳，詹冬玲，崔敬愛，等.抗菌肽Japonicin Ⅱ基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表達[J].中國釀造，2009，28（12）：23-25.

[26]李國棟，錢承軍，陸 敏，等.一組人工合成抗菌肽的研究[J].微生物學報，2006，46（3）：492-495.

[27]SHIN S H,KIM B,PARK S,et al.Haloganan:a novel antimicrobial peptide for treatment of wound infections[J].Peptides,2014,62（12）:137-143.

[28]趙喜紅，何小維，羅志剛，等.抗菌肽的生物活性、作用機制及應用研究進展[J].中國釀造，2007，26（4）：1-5.

[29]張果蘋，汪桂玲，郭詩照，等.背角無齒蚌抗菌肽theromacin基因cDNA全序列克隆及表達分析[J].水產學報，2014，38（5）：662-670.

[30]冷明壘.蒼蠅抗菌肽SK84 的表達純化及其結構和功能的初步研究[D].武漢：華中科技大學碩士論文，2011.