高產DHA裂壺藻突變株的選育

呂小義，付杰，尹佳，田華，陳濤，何東平*

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北武漢430023；2.中國科學院武漢病毒研究所，湖北武漢430071）

高產DHA裂壺藻突變株的選育

呂小義1，付杰1，尹佳1，田華1，陳濤2，何東平1*

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北武漢430023；2.中國科學院武漢病毒研究所，湖北武漢430071）

利用60Co-γ射線輻照誘變裂壺藻（Schizochytrium limacinum）ATCC20888，以平板生長情況、生物量、含油率和二十二碳六稀酸（DHA）產量為綜合指標，最終選育出一株高產突變株，命名為1.6-7-1，其搖瓶發酵生物量為47.37 g/L，油脂含量為31.41%，DHA產量為5.65 g/L，且DHA產量較出發菌株提高了約40%，經連續5代發酵培養，其遺傳性能穩定。

60Co-γ射線；裂壺藻；二十二碳六烯酸

自世界衛生組織正式推薦嬰幼兒生長發育的早期階段要及時補充二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），其就以其獨特的生理功能愈發成為人們關注的焦點[1-3]。近年來，DHA行業迅猛發展，產量逐年上升。因此開發高效低廉的DHA生產工藝不僅有助于改善目前DHA研發生產現狀，更可以推廣至其他多不飽和脂肪酸類產品的開發[4-7]。

DHA俗稱腦黃金，是一種對人體非常重要的多不飽和脂肪酸，因其含有6個不飽和烯鍵的特有結構，使它具有獨特的生理功能和經濟價值，對人類健康有著特殊的作用和影響[8-9]。

裂壺藻（Schizochytrium limacinum）又稱裂殖壺菌，是一類富含DHA的海洋藻類，因其生長速度快、易于培養、細胞內脂肪酸組成簡單易于提純等優勢，被認為是一種極具潛力的DHA新來源[10-13]。

美國Martek公司在微生物發酵生產DHA領域進行了深入研究，將裂壺藻發酵生物量提高至200 g/L，DHA產量提升至40 g/L，居世界領先水平。近年來國內高校對裂壺藻發酵產DHA也開展了研究，并取得一定進展，但產量和質量均較國外尚有一定差距，不能夠滿足巨大的市場需求。

本研究以裂壺藻（Schizochytrium limacinum）ATCC 20888為出發菌株，利用60Co-γ射線對其進行輻照誘變，篩選出最優突變株[14]，用以改善生長培養條件，增加生物量，累積較多的油脂和DHA，用以達到工業生產的目的[15-17]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

裂壺藻（Schizochytrium limacinum）ATCC20888：廣東微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養基

平板與斜面培養基：葡萄糖50 g/L，谷氨酸鈉30 g/L，酵母膏6 g/L，NaCl 8 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO46 g/L，金屬離子混合液2 mL。

種子培養基：葡萄糖85 g/L，谷氨酸鈉60 g/L，酵母膏6 g/L，NaCl 20 g/L，KH2PO46 g/L，MgSO422 g/L，Na2SO40.3 g/L，金屬離子混合液2 mL。

發酵培養基：葡萄糖75 g/L，谷氨酸鈉15 g/L、酵母膏6g/L、NaCl2.4g/L，KH2PO44.8g/L，MgSO46g/L，KCl0.4g/L，金屬離子混合液2.8 mL。

1.1.3 化學試劑

葡萄糖、碳酸氫鈉、硫酸鈉：天津博迪化工股份有限公司；酵母膏：北京奧博星生物技術有限責任公司；磷酸二氫鉀：天津凱通化學試劑有限公司；堿性蛋白酶（20萬U/g）、纖維素酶（5萬U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Agilent 7890A氣相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司；SPX-150C恒溫恒濕箱、9070MBE電熱鼓風干燥箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；YM75立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫療器械有限公司；RE-52C旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；HYQ-150S全溫搖床：武漢匯誠生物科技有限公司；GZX-XB-K-25血球計數板：鹽城市榮康玻璃儀器有限公司；60Co-γ輻照源：湖北省農科院輻照中心。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將菌種轉接至富集培基上，于26℃條件下恒溫靜置培養2～3 d。菌種經富集后，在分離平板上劃線分離，26℃恒溫培養，經多次分離獲得裂壺藻單菌落菌株。挑選純的單菌落作為活化種子轉接液體培養基擴大培養。

1.3.2 種子培養

從平板中純的單菌落處挑取一環，轉接于種子培養基中，置于搖床上26℃、180 r/min條件下培養48 h。

1.3.3 發酵培養

將種子液按10%的接種量轉接于發酵培養基中，26℃、180 r/min條件下振蕩培養4～5 d。

1.3.4 制備待誘變懸浮液

從活化后的裂壺藻種子中挑選出菌落較大、較純，生長較快的進行鏡檢，選擇細胞較大，特征典型的經種子培養后，轉接發酵培養基，培養至對數期。離心去除上清液，用無菌生理鹽水制成懸浮液，血球計數板計數，調整細胞濃度在107～109CFU/mL，待誘變處理。

1.3.560Co-γ輻照誘變

取12支滅菌過的試管，每管分別裝入上述懸浮液5 mL。每3個為一組，共分為4組，在湖北省農科院輻照中心進行60Co-γ射線輻照，各組劑量分別為0.4 kGy、0.8 kGy、1.2 kGy、1.6 kGy，剩下的原懸浮液作為對照組。菌株致死率計算公式如下：

式中：A為未經誘變平板上的菌落數，CFU；B為經過誘變后平板上的菌落數，CFU。

1.3.6 突變株的篩選

經過誘變處理的懸浮液經適量稀釋平板涂布，26℃培養3 d，觀察菌落長勢、大小并記錄菌落數。挑選形態大，表面光滑的單菌落進行初篩，然后對初篩得到的菌株在發酵培養基中復篩，26℃、180 r/min培養5 d，檢測其生物量、油脂含量、DHA產量，保存產量較高的菌種。

1.3.7 突變株遺傳穩定性測試

將復篩得到的突變株連續傳至5代，再對其進行搖瓶發酵培養，測定生物量、含油量和DHA產量并與初代進行比較，觀察其遺產穩定性。

1.3.8 生物量的測定

裂壺藻的生物量以收集的菌體細胞干質量計。取一定體積的培養液裝入預先稱質量的離心管中，5 000 r/min離心20 min，沉淀用蒸餾水清洗3次，置于干燥箱中，60℃條件下烘干至質量恒定，稱質量。生物量的計算公式如下：

1.3.9 油脂的提取及DHA含量測定

藻油的提?。簩㈦x心洗滌得到的藻泥與水按料液比1∶1（g∶mL）混合，用堿性蛋白酶0.5%和纖維素酶0.025%在60℃條件下酶解6 h，真空冷凍干燥至質量恒定，研磨成藻粉，用乙醚索氏抽提至菌體至無色，旋轉蒸發殘留溶劑，置于烘箱干燥至兩次質量變化＜0.2 mg，計算油脂質量。油脂產量及含油率的計算公式如下：

DHA含量檢測：取0.1 g藻油，加1 mL苯-石油醚體積比為1∶1的混合溶劑，再加1 mL 0.4 mol/L的KOH-CH3OH溶液，搖勻，在室溫條件下靜置8～10 min，然后加蒸餾水使醚層升至瓶頸部，待液層澄清后，經氣相色譜分析得到DHA相對含量。DHA產量計算公式如下：

DHA產量（g/L）=油脂產量（g/L）×DHA含量（%）

1.3.10 氣相色譜分析條件

色譜柱：Agilent SP-2560（100 m×25 μm，0.2 μm）；升溫程序：100℃保持4 min，以3℃/min升溫至230℃，保持20 min，載氣（N2）流速25 mL/min，壓力2.4 kPa，進樣量1 μL；分流比15∶1。

2 結果與分析

2.160Co-γ射線輻照對裂壺藻ATCC20888的致死效應

裂壺藻ATCC20888經過不同劑量的輻照處理后，劑量與裂壺藻致死率之間的關系如圖1所示。由圖1可知，不同劑量對ATCC20888菌株均有致死效應，且致死率與60Co-γ射線輻照劑量在一定范圍內成正相關，劑量越大，菌株致死率越高。當輻照劑量為0.8kGy時，致死率為98.76%，輻射劑量為1.6 kGy時，致死率為99.985%。

2.2 初篩

挑取4個輻照處理組中直徑較大的菌落，每組選20個，共80個單菌落，每個菌落劃2個平板，共160個平板。置于恒溫恒濕培養箱培養3 d。

在以上160個平板中挑選生長快速、無污染、單菌落多且直徑大的平板，在其中挑選出40個單菌落平板劃線，分別命名為0.4-1～0.4-10、0.8-1～0.8-10、1.2-1～1.2-10、1.6-1～1.6-10置于恒溫恒濕培養箱培養3 d。通過比較菌落大小，形狀、顏色、透明度、鏡檢細胞大小、污染度、生物學特征等指標，篩選出24單株。其中包括0.4 kGy 4株，0.8 kGy 6株，1.2 kGy 5株，1.6 kGy 9株。

將以上挑選出的24單株各取一環接入裝有5 mL液體培養基的試管中，每株接入3管，共72個試管，置于搖床上，26℃、180 r/min條件下振蕩培養7 d后進行涂片、蘇丹黑B染色、顯微鏡鏡檢。根據污染與否、細胞大小、培養液澄清度、油脂積累量等綜合指標篩選出較好的24株，其中包括0.4 kGy處理組4株，0.8 kGy處理組6株，1.2 kGy處理組4株，1.6 kGy處理組10株。準備復篩。

2.3 搖瓶復篩

2.3.1 第一輪復篩

將初篩得到的24株突變菌株和1株出發株分三個批次分別經種子培養后，以10%接種量轉接于裝有100 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，置于搖床上，在26℃、180 r/min條件下振蕩培養5 d。放瓶后每株分別取樣進行涂片和蘇丹黑B染色鏡檢。每株菌株的發酵液在40～55℃條件下烘干至質量恒定，測定干質量。其結果見表1。

由表1可知，經誘變后的24株突變株與出發株相比，其平均生物量大部分都有小幅度提升。根據24株突變株的生長發育情況、蘇丹黑B染色鏡檢結果及生物量等指標，與出發株相比篩選出較好的7株（0.4-7-2、0.4-9-1、0.8-6-2、1.2-5-1、1.6-1-1、1.6-7-1、1.6-9-3）進行下一輪的篩選。

2.3.2 第二輪復篩

將上輪篩選出的7株突變株與出發菌株經種子培養、搖瓶發酵培養5 d，取樣涂片和蘇丹黑B染色鏡檢、以生物量、油脂含量、DHA產量為指標篩選最優突變株。結果（表2）可知，1.6 kGy劑量下有2株突變株其DHA產量超過5 g/L，可以猜想高劑量的輻照強度對正突變有利。經各項指標比較分析，選出3株較優菌株分別為0.8-6-2、1.6-7-1、1.6-9-3。

2.3.3 第三輪復篩

第三輪復篩結果見表3。由表3可知，突變株1.6-7-1其各項指標都優于出發株和其他突變株。經過幾輪篩選，選出最優突變株1.6-7-1，其生物量為47.37 g/L，DHA產量為5.65 g/L。

2.4 突變株遺產穩定性實驗

經過初篩復篩選出的正突變株1.6-7-1，經過5代連續轉接后進行發酵培養，比較每代菌株發酵5 d后生物量、油脂產量、DHA產量，結果見表4。由表4可知，該突變株遺產性能較為穩定，其油脂產量均有大幅度提升，證明了輻照誘變的可行性和科學性。

2.5 脂肪酸組成分析

將1.6-7-1突變株經發酵所產的藻油進行氣相色譜分析，結果見表5。由表5可知，裂壺藻脂肪酸組成主要為C16∶0和C22∶6n-3，其中二十二碳六烯酸（DNA）的含量達到了39.92%，表明1.6-7-1突變株經發酵所產的藻油是DNA的良好來源。并且其脂肪酸組成簡單，利于提純。

3 結論

本實驗利用60Co-γ射線在1.6 kGy的輻射劑量下誘變，最終篩選得到了一株命名為1.6-7-1的高產DHA的裂壺藻突變株，其平均DHA產量為比出發株提高了約40%，其藻油脂肪酸組成簡單，利于提純，具有良好的商業前景，在以后的研究中可采取復合誘變或者基因重組的方法，同時優化培養基成分及培養條件，有望進一步提高DHA產量，縮小商業成本。

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Lü Xiaoyi1,FU Jie1,YIN Jia1,TIAN Hua1,CHEN Tao2,HE Dongping1*
(1.College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China; 2.Wuhan Institute of Virology,Chinese Academy of Sciences,Wuhan 430071,China)

Schizochytrium limacinumATCC20888 was mutated by60Co-γ ray irradiation.Using flat growth condition,biomass,oil content and docosahexaenoic acid(DHA)yield as comprehensive indexes,a mutant strain 1.6-7-1 with high DHA yield was screened.The biomass of the strain was 47.37 g/L,oil content was 31.41%,and DHA yield was 5.65 g/L,which was increased by about 40%than the original strain.After five consecutive generationsoffermentation,itsgenetic stabilitykeptwell.

60Co-γ ray;Schizochytrium limacinum;docosahexaenoic acid

Q933

A

0254-5071（2015）04-0106-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.024

2015-03-24

國家糧食局糧食公益性行業科研專項（201313012-03）

呂小義（1991-），男，碩士研究生，研究方向為微生物油脂。

*通訊作者：何東平（1957-），男，教授，博士，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白。