山茱萸中有益菌的分離和鑒定

唐艷敏，孫思佳，翟政濤，紀飛

（河南工業大學生物工程學院，河南鄭州450001）

山茱萸中有益菌的分離和鑒定

唐艷敏，孫思佳，翟政濤，紀飛

（河南工業大學生物工程學院，河南鄭州450001）

將藥用植物山茱萸作為有益菌的分離源，以獲得常見有害菌的抗性菌，提高山茱萸的利用價值。以馬鈴薯葡萄糖瓊脂和營養瓊脂平板分離、純化其體外真菌和細菌，對獲得的菌株進行黑曲霉、黃曲霉和大腸桿菌等有害菌的對峙實驗，并對抗性菌進行分子生物學和生理生化的種屬鑒定。實驗結果表明：從山茱萸中分離純化28株菌（12株細菌、16株真菌），其中2株菌對黑曲霉、黃曲霉有一定的抑菌效果，經分子生物學和生理生化實驗鑒定，菌株S136是腸桿菌屬（Enterobactersp.）、菌株S138是芽孢桿菌屬（Bacillussp.）的細菌。

山茱萸；有益菌；分離鑒定；抗黑曲霉；抗黃曲霉

有益菌即對人體健康有益或是對人類生命活動有益的微生物[1]。篩選有益菌的原則是在自然對抗狀態下，尋找能為人類不同生命活動所用的菌株[2]；自1993年STIERLE A[3]等從短葉植物紅豆杉內分離出了一株能產紫杉醇的菌株后，植物成了除去土壤和水體外，人們尋找有益菌的另一來源；有益菌具有抗菌[4]、抗蟲[5]、防腐[6]等作用，因此對于這類微生物的篩選具有很高的應用價值。

山茱萸（Cornus officinalisSieb.et Zucc.）是一種落葉灌木，在河南、甘肅、浙江、湖南等省均有分布，其果實別稱山萸肉，是一種藥用價值極高的植物，具有補血固精、補益肝腎、調氣、補虛、明目等功效[7]，被作為六味地黃丸的主要原料藥使用[8]，對其體內外微生物資源的挖掘是充分利用微生物自然資源、提高藥用植物利用（應用）價值的一種較好的方法[9]。本試驗將山茱萸作為有益菌的微生物篩選來源，對獲得的有益菌進行種屬鑒定，以提高山茱萸的利用價值，獲得有益菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

山茱萸：河南省西峽縣山茱萸種植基地。采集后放保鮮袋帶回以保持新鮮，當天進行試驗，未用完材料用保鮮膜包裹并置于4℃冰箱，延長保存時間。

大腸桿菌（Escherichia coil）CVCC8099：購自中國獸醫藥監察所；黑曲霉（Aspergillus niger）、黃曲霉（Aspergillus flavus）：由河南工業大學生物工程學院保藏；所用試劑均為國產分析純。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體培養基：土豆200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

營養瓊脂培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。

1.2 儀器與設備

SPX-150BS-Ⅱ生化培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養箱：上海浦東榮豐科學儀器有限公司；DHP-9162恒溫培養箱、TH2-C恒溫搖床：太倉市科教器材廠；VITZK-z全自動微生物分析儀：波舜宇儀器有限責任公司；3730XL測序儀、2720 thermal cycler PCR儀：Applied Biosystems；DYCP-31DN DNA電泳槽、DYY-5穩壓電泳儀：北京六一儀器廠；DK-8D電熱恒溫水槽：上海一恒科學儀器有限公司；FRP980凝膠成像儀：上海復日科技儀器有限公司；HC-2518R冷凍高速離心機：賽齊（上海）生物工程有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 山茱萸中菌種的分離與純化

取新鮮山茱萸的枝、莖、葉和果實，流水沖洗塵土后，置超凈工作臺內，用無菌水沖洗，將枝、莖截成1～2 cm長，葉、果半徑為0.5～1.0cm，分為A、B組：將A組材料移至營養瓊脂培養基上，空白對照加無菌水，于37℃恒溫培養1～2d；將B組材料移至PDA培養基上，空白對照加無菌水，于28℃恒溫培養4～6 d。對生長的菌株按菌落形態進行分離、純化、保種。

1.3.2 山茱萸有益菌的篩選

抗大腸桿菌（Escherichia coli）菌株的分離：采用平板對峙法，將菌體濃度為4×107CFU/mL的大腸桿菌液均勻涂布到培養基上，然后在平板上接種純化的分離菌，37℃培養3～4 d，逐日觀察2種菌的生長狀況和對峙抑制效果，拍照記錄。

抗黑曲霉（Aspergillusniger）、黃曲霉（Aspergillusflavus）菌株的分離：在PDA培養基中央分別接種黑曲霉、黃曲霉為對照，實驗組除在中央接種黃曲霉、黃曲霉外，還在距中央20～25 mm處用直徑為5 mm的打孔器打4個孔，構成正方形，取培養3 d的菌懸液注入孔中，28℃培養3～4 d，逐日觀察對照和實驗平板真菌生長狀況，以對照組菌落直徑與實驗組菌落直徑差作為抑菌性大小，拍照記錄。

1.3.3 山茱萸有益菌的分子生物學鑒定

將有抗性的菌株送上海生工生物公司進行分子生物學種屬鑒定。細菌基因組DNA提取按SK8255試劑盒的操作手冊進行。16S rDNA測序采用通用引物，上引物為7F（5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′），下引物為1540R（5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）；真菌基因組DNA采用SK8259試劑盒提取，18S rDNA測序采用通用引物，上引物為NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′），下引物為NS6（5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′）。

25μL擴增體系：2.5μL的10×buffer（含MgCl2），各0.5μL的10 μmol/L的上下引物，1 μL的2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyibonucle oside triphosphate，dNTP），0.2 μL的TaqDNA聚合酶，0.5 μL的20～50 ng/μL基因組DNA模板量，加無菌水至25μL。擴增條件為：94 ℃預變性4min，94℃變性45 s，55℃褪火45 s，72℃延伸1 min，30個循環后最終72℃保持10 min。獲得的16S rDNA序列在核糖體數據庫http：//rdp.cme.msu.edu/index.jsp上比對，18S rDNA的序列在NCBI上采用Blast軟件進行比對，以進化樹同源性比例顯示種屬類型。

1.3.4 山茱萸抗性菌的生理生化鑒定

將獲得的有益菌株用VITZK-z全自動微生物分析儀進行生理生化測定，以了解菌株的生物學特性。

2 結果與分析

2.1 山茱萸中菌種的分離與純化

自山茱萸中共分離菌株28株（12株細菌，16株真菌）。其中，莖中獲得14株、枝中獲得8株、葉中獲得4株、果實中獲得2株。菌株分布情況表現為自植株形態學的下端向形態學的上端呈現逐步減少的趨勢。

2.2 有益菌的抑菌性

通過抗大腸桿菌、抗黑曲霉、抗黃曲霉的對峙實驗，自純化的山茱萸中獲得2株抗性菌，分別編號為S138、S136，其抑菌圈直徑和抑菌效果分別見表1。

經過純化的有益菌S138和S136見圖1。由圖1可知，S138菌落呈白色，大、不規則，邊緣呈鋸齒狀，菌落扁平、表面干澀，邊緣呈褶皺樣。S136菌落呈淡黃色、半透明，菌落直徑約0.5～1.0 cm，表面隆起、濕潤、光滑，邊緣整齊。

2.3 山茱萸抗性菌的分子生物學鑒定

對菌株S136和S138進行16S rDNA的PCR擴增，結果見圖2。

由圖2可以看出，擴增的S136、S138菌株16S rDNA序列條帶明亮，無明顯的拖帶現象，證明分離的序列大小穩定，大致在1 500 bp左右，經測序獲得S138和S136的rDNA序列分別為1 472 bp、1 499 bp，結果見圖3和圖4，在NCBI數據庫中進行比對，獲得該菌株的種屬分類。

S138的rDNA片段大小為1 472 bp，測序結果見圖3。S136的rDNA片段大小為1 499 bp，測序結果見圖4。

由圖3可知，經比對，S138與細菌界、厚壁菌門、芽孢桿菌綱、桿菌目、芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬的細菌同源性為100%。

由圖4可知，經比對，S136與細菌界、變形菌門、變形菌綱、腸桿菌目、腸桿菌科、腸桿菌屬的細菌同源性約為98%。

2.4 山茱萸抗性菌生理生化結果分析

將2株有益菌經VITZK-z全自動微生物分析儀的檢測，S138菌株采用BCL卡（革蘭氏陽性細菌鑒定卡），S136菌株采用GN卡檢測2株有益菌的生理生化反應特性，結果分別見表2、表3。

根據2株有益菌的生理生化特性，與分析儀內貯藏信息比對，鑒定結果同分子生物學鑒定一致，上述大量的生理生化分析數據為S138、S136菌株的應用提供了完整的信息。

2.5 討論

本試驗共獲得2株對黑曲霉、黃曲霉有明顯抗性的細菌。這對于生物防治真菌、特別是生物方法防治糧食中霉變菌的污染具有重要的意義[10]。有益菌不僅能減少化學防腐劑的毒性，而且長期使用也不會對生態環境造成一定的威脅，還對人類的健康有益[11-12]。從安全、健康、環保的多角度來說，對于抵抗黑曲霉、黃曲霉等常見霉變菌菌株的開發研究可以為食品防腐、糧食防霉提供新的思路、尋求新的方法[13]。

目前菌物的許多序列系統發育研究都集中在核編碼的核糖體基因上，包括較大的重復數量、不平常的堿基比率，以及DNA引物較早的出現，rDNA基因不同區域的進化速率顯著不同，使得其能夠在確定菌株分類地位中得到應用[14]。各種精密儀器高通量的檢測也對實驗起到了很大的幫助，全自動微生物分析儀能夠在24 h內得到47個生理生化反應特性的結果，大大提高了試驗的效率，為試驗的下一步研究節省了大量時間。

理想有益菌的各種特性很難集中于自然微生物體中，因此，除了在篩選途徑上進行深入探索外[15]，有益菌的定向遺傳改造及其活性代謝產物的研究也是未來的方向。

3 結論

以山茱萸為有益菌的來源，自山茱萸中分離28株菌，其中S138、S136對黑曲霉、黃曲霉有明顯抑菌效果，經分子生物學鑒定與生理生化鑒定，確定S136是腸桿菌屬、菌株S138是芽孢桿菌屬的細菌。實驗證實，山茱萸體外存在有應用價值的抗性菌株，可作為抗性菌的分離資源。

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TANG Yanmin,SUN Sijia,ZHAI Zhengtao,JI Fei
(College of Biological Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China)

The aim of this research is to obtain the beneficial microbes fromCornus officinalis,the traditional medical plant in China,and then raise the application value ofC.officinalis.The fungi and bacteria fromC.officinaliswere isolated and purified by potato dextrose agar and nutrition agar, respectively.Then antagonist tests were performed between the obtained microbes and harmful microbes,such asAspergillus niger,Aspergillus flavus,andEscherichia coli.The beneficial microbes were identified by molecular biological identification and physiological and biochemical identification.The results showed that 12 bacterial strains and 16 fungal strains were isolated fromC.officinalis,in which 2 bacterial strains showed certain bacteriostatic effect onA.nigerandA.flavus.After the identification,results showed that strain S136 wasEnterobactersp.,and strain S138 was Bacillussp.

Cornus officinalis;beneficial microbe;isolation and identification;anti-Aspergillus niger;anti-Aspergillus flavus

Q939.9

A

0254-5071（2015）04-0097-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.022

2015-03-09

大學生挑戰杯比賽項目

唐艷敏（1990-），女，本科生，研究方向為藥用植物的有益菌。