一株冬蟲夏草菌的液態發酵條件研究

羅園香，盛嘉俊，葉克難*

（中山大學生命科學學院，廣東廣州510275）

一株冬蟲夏草菌的液態發酵條件研究

羅園香，盛嘉俊，葉克難*

（中山大學生命科學學院，廣東廣州510275）

以菌絲體干質量、胞內多糖含量及腺苷含量為評價指標，研究了一株冬蟲夏草菌的液態發酵條件。確定利用葡萄糖蛋白胨液體培養基發酵生產菌絲體、胞內多糖及腺苷的最佳條件為裝液量100 mL/500 mL，接種量3%，溫度24℃，培養時間4 d，搖床轉速140 r/min；試驗得菌絲體干質量為17.232 g/L；胞內多糖含量為78.34 mg/g；腺苷含量為633.7 μg/g。

冬蟲夏草；菌絲體；胞內多糖；腺苷

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）是中華蟲草菌寄生于蝙蝠蛾幼蟲體后發育成的真菌子座（謂之“草”）和充滿菌絲的僵死幼蟲（謂之“蟲”）的復合物，在分類學上，冬蟲夏草隸屬于真菌門、子囊菌亞門、核菌綱、肉座菌目、麥角菌科、蟲草屬[1]。冬蟲夏草化學成分復雜，含有蟲草素、核苷類、氨基酸、多肽、多糖類、糖醇、甾醇類、脂肪酸、酯、烷烴、多胺類物質等活性成分[2]。具有抗腫瘤[3]、抗衰老[4]、增強心肌耐缺血缺氧能力、抗心率失常[5]，調節內分泌[6]、免疫力[7]、脂類代謝[8]，鎮靜中樞神經系統[9]等多種藥理功能。

近來由于生態環境的退化和人為的過度采挖，蟲草的產量大幅下降，而且個體變小，質量也有所下降，冬蟲夏草自然資源日益枯竭且價格昂貴，已不能滿足人們對蟲草日益增長的需求[10]。通過人工培養獲得冬蟲夏草，給這一名貴藥材繼續長久為人類服務提供了一條新思路。近來國內外眾多研究機構在冬蟲夏草人工培育、人工菌絲體生產、成分、藥理等方面做了大量工作，研究表明，人工蟲草菌絲體與天然冬蟲夏草具有相似的化學成分[11]、藥理作用和臨床療效[12]，且毒性比天然少，為人工培養蟲草菌絲體代替天然冬蟲夏草提供了科學依據。

迄今為止，深層發酵研究已取得較大進展，通過液態深層培養可以實現菌絲體的快速生產，同時通過優化培養條件，以提高其生物活性物質的含量，便于提取目的組分[13]。此外，還可通過連續性地大規模工業化生產，消除某些難以控制的環境因子，縮短生產周期，降低生產成本，為深加工提供廣泛的應用領域[14]。因此，深層發酵培養冬蟲夏草具有重要的理論和實踐意義。實驗對冬蟲夏草液態發酵生產胞內多糖、腺苷和菌絲體的發酵條件進行研究，以期為冬蟲夏草的工業化生產提供必要的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）：廣東省微生物菌種保藏中心；標準品腺苷：美國Sigma公司；實驗所用其他試劑如無特殊說明均為分析純。

斜面培養基：馬鈴薯汁20%、葡萄糖2.0%、瓊脂2.0%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.15%、pH值自然；

種子培養基：馬鈴薯汁20%、葡萄糖2.0%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.15%、pH值自然；

發酵培養基：葡萄糖2.0%、蛋白胨1.0%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.15%、VB10.08%、pH值自然。

1.2 儀器與設備

ZHWY-211B恒溫培養振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司；ES-15精密鼓風烘箱：施都凱儀器設備（上海）有限公司；VB800超聲波破碎儀：美國Sonics公司；745紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 培養方法

斜面培養：將保藏的冬蟲夏草菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA），25℃恒溫培養5 d，于4℃冰箱中保存備用。

種子液培養：將活化的斜面菌種接入種子培養基中，于140 r/min、24℃搖床培養3 d。

發酵培養：在500 mL的錐形瓶中加入發酵培養基，裝液量分別為50 mL、100 mL、150 mL、200 mL和250 mL，分別按體積分數2%、3%、4%、5%和6%接種量接入液體種子，選取20℃、22℃、24℃、26℃和28℃5個溫度，發酵時間為3 d、4 d、5 d、6 d和7 d，搖床轉速分別為100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min和180 r/min進行發酵培養。

1.3.2 菌絲體干質量的測定

將發酵液以3 000 r/min離心分離15 min，棄去上清液，用蒸餾水反復沖洗，重復離心后，于60℃烘干至質量恒定，稱取菌絲體干質量。

1.3.3 胞內多糖含量的測定方法

（1）溶液的配制

葡萄糖標準溶液：精密稱取于105℃干燥至質量恒定的葡萄糖0.050 0 g，置于250 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，即得0.2 mg/mL的標準溶液。

6%苯酚溶液：精密稱取6 g重蒸苯酚，置于100 mL棕色容量瓶中，用蒸餾水稀釋并定容，放入4℃冰箱中冷藏保存，備用。

（2）葡萄糖標準曲線的制作

精密吸取葡萄糖標準溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL于15 mL具塞試管中，分別加水至2.0 mL，并加入6%苯酚溶液0.5 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸4.5 mL，振蕩搖勻，室溫放置10 min。另取2.0 mL蒸餾水按上述方法操作，作為空白對照。在波長490 nm處測定吸光度值。以葡萄糖含量（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，得回歸方程。

（3）胞內多糖的測定[15]

精確稱取0.500 g干燥菌絲體于試管中，加入15 mL蒸餾水，超聲破碎10 min之后，置于90℃恒溫水浴鍋中浸提2 h，離心得上清液即為樣品溶液。吸取樣品溶液0.1 mL，置于15 mL具塞刻度試管中，加水至2.0 mL，并加入6%苯酚溶液0.5 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸4.5 mL，振蕩搖勻，室溫條件下放置10 min。另取蒸餾水0.1 mL同上操作制得空白溶液。于波長490 nm處測定吸光度值，并計算出胞內多糖含量。

1.3.4 腺苷含量測定方法

（1）溶液的配制

提取液：無水甲醇與高純水按體積比1∶1配制成提取液，保存備用。

腺苷標準溶液：精密稱取腺苷標準品20 mg，置100 mL容量瓶中，加提取液溶解，搖勻，定容至刻度，得質量濃度為0.2 mg/mL的標準溶液。

（2）色譜條件[16]

色譜柱Shimadzu VP-ODS（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫30℃；流動相水∶甲醇（85∶15），流速1.0 mL/min；進樣量20 μL；檢測器波長為260 nm。

（3）腺苷標準曲線的制作

精密吸取腺苷標準溶液0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL于15 mL具塞試管中，分別加提取液至10.0 mL，搖勻。分別以進樣量20 μL進樣，記錄峰面積。以腺苷含量（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制腺苷標準曲線，得回歸方程。

（4）腺苷含量的測定

精密稱取冬蟲夏草菌絲體0.250 g，置具塞錐形瓶中，加入提取液10 mL，超聲提取，離心，上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾后即得樣品溶液。按照1.3.4節色譜條件進樣分析，記錄峰面積，并計算出腺苷含量。

2 結果與分析

2.1 裝液量對菌絲體干質量及胞內多糖和腺苷含量的影響

在500 mL的錐形瓶中加入發酵培養基，裝液量分別為50 mL、100 mL、150 mL、200 mL和250 mL，按體積分數4%接種量接入液體種子，在溫度24℃、搖床轉速120 r/min條件下發酵培養4 d，結果見表1。

發酵液為菌絲體的生長提供了營養物質，而裝液量多少不僅反映了營養物質的多少，也會直接影響發酵過程中的通氣量。由表1可知，在裝液量為50～100mL/500mL時，隨著裝液量的增加，菌絲體干質量及胞內多糖和腺苷含量均呈上升趨勢；當裝液量為100 mL/500mL時，菌絲體干質量及胞內多糖和腺苷含量均為最高；在裝液量超過100 mL/500mL時，菌絲體干質量及胞內多糖和腺苷含量均呈下降趨勢。所以，應選擇100 mL/500mL的裝液量。因培養基量少，易導致培養過程中營養缺乏，而培養基裝液量太多，則培養過程中通氣效果不理想，這樣都會影響菌種生長繁殖。

2.2 接種量對菌絲體干質量及胞內多糖和腺苷含量的影響在10個裝液量為100 mL/500 mL發酵培養基中，每兩個為一組，分別按體積分數2%、3%、4%、5%和6%接種量接入液體種子，在溫度24℃、搖床轉速120 r/min條件下發酵培養4 d，結果見表2。

接種為發酵過程提供了生長旺盛生命力強的種子，接種量的大小對于發酵周期、產量具有明顯的影響，由表2可知，隨著接種量的增加，所得菌絲體干質量及胞內多糖和腺苷含量均呈上升趨勢，并在3%時達到最大值；當接種量＞3%時，所得菌絲體干質量呈平緩下降，胞內多糖及腺苷含量也相應減少，與菌絲體產量呈現出一定的正相關性。所以，最佳接種量應選擇3%。

2.3 溫度對菌絲體干質量及胞內多糖和腺苷含量的影響

在裝液量為100 mL/500 mL發酵培養基中，按體積分數3%接種量接入液體種子，選取20℃、22℃、24℃、26℃和28℃5個溫度，在搖床轉速120r/min條件下發酵培養4 d，結果見表3。

在發酵過程中，穩定合適的溫度是保證酶活性的重要因素。由表3可知，冬蟲夏草在20～28℃均能生長，隨著溫度的升高，菌絲體干質量、胞內多糖及腺苷含量均呈先上升后下降趨勢。原因可能是溫度升高，生長加快，菌絲體出現一定的自溶現象。在24℃時菌絲體干質量、胞內多糖及腺苷含量均達到最大。所以，培養溫度應選擇24℃。

2.4 發酵時間對菌絲體干質量及胞內多糖和腺苷含量的影響

在裝液量為100mL/500mL發酵培養基中，按體積分數3%接種量接入液體種子，在溫度24℃、搖床轉速120 r/min條件下分別發酵培養3 d、4 d、5 d、6 d和7 d，結果見表4。

發酵周期是確定發酵終止時間的最終依據。從表4可知，菌絲體培養4 d的產量最高，而胞內多糖與腺苷含量在5 d時最大，但與4 d相比，增加不明顯。在發酵進行5 d以后，菌絲體干質量和胞內多糖、腺苷含量均開始下降，這可能與菌絲體自溶過程中分泌的各種酶使胞內多糖和腺苷分解有關。綜合考慮，選擇最佳培養時間為4 d。

2.5 搖床轉速對菌絲體干質量及胞內多糖和腺苷含量的影響

在裝液量為100 mL/500 mL發酵培養基中，按體積分數3%接種量接入液體種子，在溫度24℃、搖床轉速分別為100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min和180 r/min進行發酵培養4 d，結果見表5。

搖床轉速的大小直接影響到發酵培養液中的溶氧水平，過高或過低都不利于菌絲體的生長。因此選擇適宜的轉速對菌絲體的生長至關重要。在上述確定的條件下，研究轉速對菌絲體干質量和胞內多糖及腺苷含量的影響。從表5可知，適當的轉速有利于蟲草菌絲體及其產物的形成，隨著轉速的加快，菌絲體及其產物的含量呈上升趨勢，但超過140 r/min時，菌絲體及其產物含量開始下降，原因可能是轉速過快，使菌絲體受到損傷。因此，選擇轉速為140 r/min。

3 結論

固體栽培冬蟲夏草周期長，勞動強度大，易受外界因素的影響。液態發酵技術生產菌絲體比人工栽培生產子實體有明顯的優越性，在液體培養中，營養成分分布均勻，利于菌絲營養體充分接觸和吸收，菌絲細胞能在反應器內處于最適溫度、pH值、溶氧和碳氮比等條件下生長繁殖，呼吸作用所產生的代謝廢氣又能及時排放，因此新陳代謝旺盛，能在短時間內產生大量的菌絲體，而且，發酵后的菌絲或產物易于分離、提取。因此，選用合適的冬蟲夏草發酵工藝，在提高菌絲體產量及其各有效成分含量的同時還可以縮短生產周期，降低生產成本。

本試驗通過對冬蟲夏草液態發酵生產胞內多糖、腺苷和菌絲體的發酵條件優化，初步得出冬蟲夏草在葡萄糖蛋白胨液體培養基下發酵的最適條件：裝液量100mL/500 mL、接種量3%、溫度24℃、培養時間4 d、搖床轉速140 r/min。在此條件下，菌絲體干質量為17.232 g/L；胞內多糖產量為78.34 mg/g；腺苷產量為633.7 μg/g。

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LUO Yuanxiang,SHENG Jiajun,YE Kenan*
(College of Life Science,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275,China)

UsingCordyceps sinensismycelia dry mass,intracellular polysaccharides and adenosine as evaluation indexes,C.sinensisprepared by liquid fermentation with the medium of glucose peptone was investigated.Through investigating the effects of fermentation conditions on their yields,the liquid volume,inoculum,fermentation temperature,time and rotation speed were optimized as 100 ml/500 ml,3%,24℃,4 d and 140 r/min,respectively.Thedryweightofmyceliumwas17.232g/L,thecontentsofintracellularpolysaccharideandadenosinewere78.34mg/gand633.7 μg/g,respectively.

Cordyceps sinensis;mycelium;intracellular polysaccharide;adenosine

Q815

A

0254-5071（2015）04-0078-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.017

2015-03-10

廣東省科技廳2008年粵港關鍵領域重點突破項目資助（粵科計字[2008]63號）

羅園香（1989-），女，碩士研究生，研究方向為應用生物技術。

*通訊作者：葉克難（1964-），男，副教授，博士，研究方向為應用生物技術。