白斑狗魚魚皮中抗凍蛋白的分離純化

田童童，鞏子路，朱新榮，張建*，牛玉靜，劉娟，李甜

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

白斑狗魚魚皮中抗凍蛋白的分離純化

田童童，鞏子路，朱新榮，張建*，牛玉靜，劉娟，李甜

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

以白斑狗魚為研究對象，選取魚皮組織為試驗材料，通過單因素及響應面試驗對魚皮抗凍蛋白提取工藝條件進行優化。以抗凍蛋白的熱滯活性（THA）作為考察指標，對提取溫度、提取液的pH值、提取時間及料液比進行探討。結果表明，在提取溫度8℃、提取液pH值為8.4、提取時間2 h，料液比1∶3.8（g∶mL）的工藝條件下，模型預測的熱滯活性為0.072 0℃。經驗證試驗，發現其熱滯活性為（0.069 0±0.002 4）℃，試驗值與預測值差異較小，表明模型具有一定可靠性。通過柱層析對白斑狗魚魚皮抗凍蛋白進行分離純化，純化后的抗凍蛋白達到電泳級，且其分子質量約為6 400 u，熱滯活性大約為（0.050 2±0.002 2）℃。

白斑狗魚魚皮；抗凍蛋白；分離；純化

生存于極端寒冷環境中的硬骨魚類，都可以合成某種抗凍蛋白、抗凍多肽或者是抗凍糖蛋白，以此來保護自身免受寒冷的迫害[1-2]。抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）又稱熱滯蛋白，具有防止生物有機體遭受凍害的特殊功能。根據抗凍蛋白不同的理化性質及結構特征將其分為4種類型，分別為AFPⅠ、AFPⅡ、AFPⅢ和AFPⅣ。然而，盡管蛋白質結構各不相同，但是所有的抗凍蛋白都可以通過與冰晶表面特異性的結合非依數性的降低溶液的冰點，從而抑制冰晶的進一步生長以達到保護體細胞的目的[3]。

起初，研究學者認為抗凍蛋白的合成僅僅局限于肝臟器官（肝型抗凍蛋白）。肝臟分泌的抗凍蛋白進入血液，通過血液流動將抗凍蛋白帶入體細胞的周圍，從而起到保護體細胞免受凍害的作用。然而，最近的研究表明，冬季比目魚和杜父魚的上皮細胞組織中具有合成抗凍蛋白（皮膚型抗凍蛋白）的功能，盡管其具有同樣的熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA），但是這類抗凍蛋白在理化性質及結構特征上都不同于肝型抗凍蛋白[4-5]。

此外，通過上皮組織分泌的抗凍蛋白缺乏信號傳導功能且與肝型抗凍蛋白的基因序列大不相同，但他們直接存在于體細胞內，因此同樣可以發揮其耐受寒冷環境的作用。據文獻報道，皮膚型抗凍蛋白已經被公認為一種新型的抗凍蛋白，棲息于寒冷的海洋環境中的魚類都具有普遍的抗凍特征[6]。更有學者認為，肝型抗凍蛋白是從皮膚型蛋白進化而來[7-8]。

抗凍蛋白因其具有熱滯活性，在冷凍食品加工與儲藏、抗凍作物栽培、漁業養殖、醫學上器官移植和冷凍手術以及工業上高級防凍劑開發中具有誘人的應用前景。盡管科學家們已經發現了數十種抗凍蛋白，然而他們仍然不斷從新的資源中尋找凍活性更強的抗凍蛋白，為開發高產量、高活性和低成本的抗凍蛋白提供更有價值的理論依據，新疆由于特殊的地理環境而使得生物具有特殊的生理特征，為研究者們尋找新的抗凍蛋白提供了良好的資源。

本試驗以生存于新疆北部額爾齊斯河流域的白斑狗魚為研究對象，以魚皮作為試驗原材料，通過傳統的分離方法，在單因素試驗的基礎上應用響應面分析法優化提取抗凍蛋白的工藝參數，并且通過陰離子交換柱層析及凝膠柱層析對抗凍蛋白進行純化，以期為今后抗凍蛋白的開發與應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白斑狗魚：購買于石河子市農貿市場；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、考馬斯亮藍R-250、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺（Acr）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四甲基乙二胺（tetramethylethylene-diamine，TEMED）：美國Sigma公司；葡聚糖凝膠Sephadex G-50、弱陰離子（DEAE）高流速瓊脂糖凝膠：美國GE-Healthcare Bio-Sciences AB公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C精密酸度計、Heraeus Multifuge X3R臺式高速冷凍離心機：美瑞泰克科技有限公司；FA1004型電子天平：上海精科電子天平廠；Mini-protein III型電泳儀：美國Bio-Rad公司；FDU-1200真空冷凍干燥機：日本Rikakikai公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將白斑狗魚麻醉，將其上皮組織從魚體剝離，用液氮冷凍后立即粉碎，于-70℃的超低溫冰箱中保存備用。稱取一定量的樣品與等體積的Tris-HCl（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC）緩沖溶液充分混合，于4℃冷藏箱中靜置過夜。然后于5 000 r/min，4℃的條件下離心分離10 min，取上清液進行冷凍干燥，即為抗凍粗蛋白[9]。

1.3.2 單因素試驗

以Tris-HCl緩沖液為提取液，分別探討不同提取溫度（-4 ℃、0 ℃、4 ℃、8 ℃、12℃）、料液比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL））、pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）和提取時間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h）對抗凍蛋白提取的影響。

熱滯活性（THA）參考VALERIO R P等[10]報道的方法進行測定。

1.3.3 響應面試驗

為了得到魚皮抗凍蛋白提取的最優工藝參數，在單因素試驗的基礎上，以熱滯活性（THA）（Y）為響應值，利用響應面分析法（response surface methodology，RSM）對魚皮抗凍蛋白的提取進一步的優化，因素與水平編碼如表1所示。

1.3.4 魚皮抗凍蛋白的純化

將抗凍粗蛋白溶解于pH 8.0的Tris-HCl緩沖溶液中，通過0.45μm的針孔濾膜過濾后過夜透析，期間更換透析液3～4次，超濾濃縮后上樣于陰離子柱，用4倍體積Tris-HCl（pH 8.0）洗脫，再用600 mL含0～0.8 mol/L NaCl的Tris-HCl進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，每5 min收集一管，分管收集。將具有活性的蛋白液濃縮至5 mL，以待下一步的凝膠層析[11]。凝膠層析參考DENG G J等[12]報道的方法。

1.3.5 SDS-PAGE電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）參照CHALKLEYRJ等[13]報道的方法進行試驗。

2 結果與分析

2.1 單因素結果分析

2.1.1 料液比對魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響

以pH值為8.0的Tris-HCl緩沖液為提取液，提取溫度設定為4℃，提取時間為1.5 h。探討不同料液比對魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響，其結果如圖1所示。

由圖1可知，隨著料液比的不斷增加，抗凍蛋白的熱滯活性呈現出先上升后下降的趨勢。當料液比達到1∶3（g∶mL）時，魚皮抗凍蛋白的熱滯活性達到最高，其THA為（0.058 0±0.004 2）℃，繼續增加料液比的比例，熱滯活性逐漸降低。抗凍蛋白的熱滯活性之所以會呈現明顯下降的趨勢，這可能是因為抗凍蛋白的濃度與其熱滯活性有關。起初抗凍蛋白的熱滯活性隨著料液比增加的增加，主要是因為其抗凍蛋白的濃度越來越高，因此熱滯活性也越來越大，隨著提取液不斷增加，在樣品中總蛋白量不變的情況下，其抗凍蛋白的濃度則隨之降低，因而造成其熱滯活性下降。

2.1.2 pH值對魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響

以Tris-HCl緩沖液為提取液，提取溫度設定為4℃，提取時間為1.5 h，料液比為1∶3（g∶mL），探討不同pH值的提取液對魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響，其結果如圖2所示。

由圖2可知，抗凍蛋白的熱滯活性隨著pH值的升高而不斷地上升，當提取液的pH值為8.0時，其熱滯活性達到最高，為（0.063 0±0.002 1）℃。當提取的pH值＞8.0時，其熱滯活性似有下降的趨勢。這可能是因為蛋白質的溶解度與提取液的酸堿性有關。在酸性條件下蛋白質的溶解度較低而在堿性條件下溶解度較高而造成的。隨著pH值的增加，更多的抗凍蛋白溶出使其濃度升高，因而熱滯活性也在不斷的增加。然而，當提取液pH值為9.0時，其熱滯活性似有下降趨勢。雖然堿性環境條件下有益于蛋白質的溶出，但是強堿會破壞抗凍蛋白的空間結構從而影響其功能性質，進而導致其熱滯活性降低。

2.1.3 提取時間對魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響

以pH值為8.0的Tris-HCl緩沖液為提取液，提取溫度設定為4℃，料液比為1∶3（g∶mL），探討不同提取時間對魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響，其結果如圖3所示。

由圖3可知，抗凍蛋白的熱滯活性隨著提取時間的延長而呈現上升的趨勢，當提取時間為1.5 h時，其熱滯活性達到最高，為（0.067 0±0.001 5）℃。然而當提取時間＞1.5 h時，抗凍蛋白的熱滯活性基本保持穩定不變。這主要是因為魚皮抗凍蛋白在提取液中溶出速率有一定的相關性，在1.5 h之前，魚皮抗凍蛋白隨著提取時間的延長而逐漸溶解于緩沖溶液中，其濃度也隨之升高，因而熱滯活性逐漸增加。然而，當提取時間＞1.5 h后，魚皮抗凍蛋白已經基本完全溶解于緩沖溶液中，其濃度達到了最大，故熱滯活性在此之后基本保持不變。

2.1.4 不同溫度對魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響

以pH值為8.0 Tris-HCl緩沖液為提取液，提取時間為1.5 h，料液比為1∶3（g∶mL），探討不同提取溫度對魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響，其結果如圖4所示。

由圖4可知，抗凍蛋白的熱滯活性隨著提取溫度的升高而逐漸增加，當提取溫度為8℃時，熱滯活性達到最高，為（0.075 0±0.001 9）℃。溫度過高會使本來生存于極端寒冷環境中的白斑狗魚魚皮蛋白發生結構變化，使得空間結構排列緊密的蛋白質變得松散，更有益于蛋白質的溶出，如此抗凍蛋白的濃度升高，熱滯活性也逐漸增加。繼續升高溫度則會使蛋白質的固有屬性發生質的變化，進而影響了抗凍蛋白的熱滯活性。

2.2 響應面分析法結果分析

在單因素試驗的基礎上，為了得到更優的分離提取抗凍蛋白的工藝參數，利用Design-Expert 8.0軟件中的中心組合設計(center composite design，CCD)原理對4個單因素進一步優化。響應面分析試驗結果如表2所示，方差分析結果如表3所示。

由表3可知，該響應面模型的P=0.000 2＜0.001，因此試驗設計及結果可靠，該模型適用于優化本試驗的工藝參數。PX2＜0.000 1，統計學表示差異極顯著，故pH值對其影響較大。各因素之間的交互作用對白斑狗魚魚皮抗凍蛋白提取的影響也較為顯著，如PX2X3=0.006 8＜0.05，說明pH值和提取時間的交互作用較顯著，同理PX2X4=PX3X4= 0.038 4＜0.05，表明pH值與料液比、提取時間與料液比之間的交互作用差異性也顯著。

各個因素經過回歸擬合后的回歸方程為：

通過軟件求解方程，并根據實際操作條件得出最優工藝條件為提取溫度8℃，提取液pH值為8.4，提取時間2 h，液料比1∶3.8（g∶mL），該條件下魚皮中抗凍蛋白熱滯活性為0.072 0 ℃。

響應曲面圖是響應值與各因素之間互相影響構成的三維立體圖形及二維等高圖，能夠較為全面的反映出其中兩兩因素之間對響應值的關系[14-15]，試驗的響應曲面如圖5所示。

由圖5A可知，對熱滯活性影響較為顯著的是pH值，而溫度影響較小。熱滯活性隨著pH值升高不斷增加，隨著提取溫度升高則未發生明顯變化。由圖5B可知，兩因素與響應值并未形成明顯的曲面圖形，熱滯活性沒有增減趨勢。由圖5C可知，料液比對魚皮抗凍蛋白的熱滯活性的影響顯著，而提取溫度則對其沒有明顯影響。熱滯活性隨著溫度不斷升高未呈現出增減趨勢，而隨著液料比的不斷上升則先呈現增后減之趨勢，故液料比的影響較大。由圖5D可知，pH值與提取時間的交互作用對白斑狗魚魚皮抗凍蛋白的熱滯活性具有明顯的二次效應，響應曲面坡度較陡，說明二者之間的交互作用對其熱滯活性的影響極顯著。由圖5E可知，pH值和液料比對熱滯活性都表現出二次效應，表明熱滯活性隨著緩沖液pH值和液料比的增加而升高，說明二者之間交互作用對熱滯活性的影響非常顯著。由圖5F可知，熱滯活性隨著提取時間的延長并沒有明顯的變化，而隨著液料比的增加則呈現出先增后減的趨勢。

綜上所述，提取溫度對白斑狗魚魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響較小，緩沖溶液的pH值對其影響較大。此外，pH值，提取時間與料液比三者之間，兩兩因素對其熱滯活性的差異性影響較為顯著。

2.3 魚皮中抗凍蛋白的分離純化

由圖6可知，經DEAE-Sepharose陰離子交換柱后有一個吸收峰出現，將該峰下的收集液經SDS-PAGE電泳檢測后為雜蛋白，如圖7A所示。將吸收峰較高的抗凍蛋白樣品收集合并，濃縮后過分子篩柱進行純化。經Sephadex G-50凝膠層析后也有吸收峰出現，經SDS-PAGE電泳檢測該峰處的蛋白質達到電泳純，其分子質量約為6 400 u，如圖7B所示，THA大約為（0.050 2±0.002 2）℃。

3 結論

白斑狗魚魚皮中抗凍蛋白提取的最佳工藝條件為提取溫度8℃、pH值為8.4、提取時間2 h，液料比1∶3.8（g∶mL），該條件下模型預測魚皮中抗凍蛋白的熱滯活性為0.072 0℃。為了驗證模型的可靠性，進行了驗證試驗，結果顯示白斑狗魚魚皮中抗凍蛋白的熱滯活性為（0.069 0±0.002 4）℃，與理論預測值基本吻合。利用離子層析及凝膠層析獲得了電泳級的魚皮抗凍蛋白，且只含有一個分子質量約為6400u的亞基。同時，測其THA大約為（0.0502±0.0022）℃。

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TIAN Tongtong,GONG Zilu,ZHU Xinrong,ZHANG Jian*,NIU Yujing,LIU Juan,LI Tian
(College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

WithEsox luciusas the research object andE.luciusskin tissue as experimental material,the antifreeze protein(AFP)was isolated and purified by single factor experiment and response surface methodology.Using thermal hysteresis activity(THA)of AFP as index,four factors of extraction temperature,extraction buffer pH,extraction time and solid-liquid ratio was optimized.Eventually,the results showed that the THA of AFP from skin tissues was up to 0.072 0℃under the condition of extraction temperature 8℃,pH 8.4,extraction time 2 h and solid-liquid ratio 1∶3.8(g∶ml),respectively.Additionally,the verification experiment revealed that the THA was(0.069 0±0.002 4)℃,similar to the experiment value,which indicated that the model was reliable.The AFP separated and purified by column chromatography was electrophoresis level,the molecular weight was 6 400 u,and the THA was about(0.050 2±0.002 2)℃.

Esox luciusskin tissue;antifreeze protein;isolation;purification

Q51

A

0254-5071（2015）04-0072-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.016

2015-01-23

國家自然科學基金（31260366）；石河子大學青年骨干教師培訓（3152SPXY01027）

田童童（1990-），男，碩士研究生，研究方向為食品生物化學。

*通訊作者：張建（1979-），男，副教授，博士，研究方向為食品生物化學研究工作。