腌漬芥菜二次發酵工藝優化及其揮發性成分分析

巢雨舟，鄧放明*

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南長沙410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙410128）

腌漬芥菜二次發酵工藝優化及其揮發性成分分析

巢雨舟1，2，鄧放明1，2*

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南長沙410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙410128）

為了改善腌漬芥菜的風味，采用單因素和正交試驗優化了腌漬芥菜人工接種二次發酵工藝。結果表明，腌漬芥菜多菌種人工接種二次發酵的優化工藝是：在室溫條件下，分別接種植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和短乳桿菌（Lactobacillus brevis）各4%，發酵時間6 d，產品的綜合感官品質最好，為32.5分。利用氣質聯用（GC-MS）對腌漬芥菜、自然二次發酵和人工接種二次發酵芥菜的揮發性成分進行了分析，腌漬芥菜共檢測出89種物質，總含量71.81%，自然二次發酵芥菜共檢測出95種物質，總含量69.26%，優化工藝人工接種二次發酵芥菜共檢測出93種物質，總含量79.45%，揮發性物質種類在經人工接種二次發酵后略有增加，并且總含量最高。

腌漬芥菜；發酵；正交試驗；揮發性成分

芥菜（Brassica juncea）是湖南省華容縣等地大面積種植的蔬菜，原來當地的農戶收獲新鮮菜以后，用腌菜壇或大水缸等腌制2～3個月左右以后而成，成品芥菜色澤金黃、具有誘人的酸香味；現在已發展成工業化大規模的生產，利用水泥窖池高鹽腌制保存，經過漂洗鹽脫、切分、拌料、包裝、殺菌等工藝制成成品，實現了常年加工生產。但是這種生產工藝存在兩個問題，一是由于芥菜是自然發酵而成，又要長時間保存，所以不可避免腌制時必須要加入大量的食鹽，高鹽環境抑制了有害微生物生長，同時也使芥菜發酵不充分，導致芥菜風味不佳。二是漂洗脫鹽過程中芥菜風味物質損失比較嚴重。

目前的研究主要集中在利用人工接種優勢乳酸菌對芥菜進行發酵[1-5]，人工接種的乳酸菌能夠在芥菜發酵菌體系中占據優勢地位，加快發酵的速度，且乳酸發酵是腌菜中最為有利的微生物作用，這種作用可以抑制其他的雜菌生長，從而提高芥菜的品質[6]，但這些研究都是以新鮮芥菜為原料而進行的，目前還沒有以工業上腌漬芥菜為原料而進行發酵的相關報道，工業腌漬芥菜處于一種半成熟狀態，可以通過后續的發酵來提高品質，本試驗采用人工接種乳酸菌來對腌漬芥菜進行第二次發酵，氣質聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析其揮發性風味物質的變化，旨在提高工業上腌漬芥菜的品質，為改進芥菜加工方法提供理論和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腌漬芥菜：湖南國泰食品有限公司；Lact.2短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、Lact.5植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：本課題組選育；MRS液體培養基：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HPX-9272MBE數顯電熱培養箱、BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；SPX-250BⅢ生化培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司；QP2010-Plus型氣相色譜質譜聯用儀：島津企業管理（中國）有限公司；Hotplate/Stirrer型磁力攪拌器：上海器仁儀器儀表有限公司；SAAB-57330U手動SPME進樣器：上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 加工工藝流程

腌漬芥菜：

新鮮芥菜→一層菜一層鹽鋪入池中，總鹽用量12%～14%→蓋上塑料膜密封，填土壓實，腌制3個月→切分→漂洗脫鹽、擠壓脫水（測得總酸含量0.59%，控制含鹽量7.5%，含水量70%～75%）

自然二次發酵芥菜：

腌漬芥菜→裝入腌菜壇→密封→常溫（24～27℃）發酵7 d

人工接種二次發酵芥菜：

1.3.2 單因素試驗

以感官評分為評價指標，分別對植物乳桿菌Lact.5接種量、短乳桿菌Lact.2接種量和發酵時間做單因素試驗，以確定各因素的影響效果和適宜范圍。

1.3.3 發酵工藝優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇如表1所示的3因素3水平進行L9（33）的正交試驗，以感官評分為評價指標來優化腌漬芥菜二次發酵工藝。

1.3.4 感官評分方法

由10名專業的食品化驗員對樣品的色澤、氣味、滋味、質地4個方面進行打分，每項計10分，滿分40分，評分標準參考表2，統計各評審員各項評分和總分的平均值。

1.3.5 頂空固相微萃取條件

取樣品約為2 g置于頂空采樣瓶中，將已經老化2 h的萃取纖維頭插入瓶中，不接觸樣品，50℃條件下萃取30 min后縮回纖維頭，將纖維頭插入氣相色譜儀進樣口熱解吸5 min后取出。

1.3.6 GC-MS聯用條件

氣相色譜條件：參照文獻[7]的基礎上略加改動，Rtx-5MS色譜柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣He，流速1 mL/min，分流比1∶5.0，進樣口溫度250℃，升溫條件：起始柱箱溫度40℃，保持3 min，然后以5℃/min升至90℃，保持5 min，再以10℃/min升至250℃，保持5 min。

質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電離電壓70 eV，離子源溫度220℃，接口溫度280℃，掃描范圍50～1 000 m/z，溶劑延遲時間4 min。

1.3.7 揮發性成分的分析

樣品經GC-MS分析后，對照質譜庫NIST 11，并結合相關的文獻[8-9]進行分析，對相似度＞70的成分進行人工定性，得到各化合物的名稱與分子式；采用峰面積歸一化法計算各化合物的相對含量。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌Lact.5接種量對二次發酵芥菜感官品質的影響

采用1.3.1節人工接種二次發酵芥菜加工工藝，接種植物乳桿菌Lact.5（1%、2%、3%、4%、5%），短乳桿菌Lact.2接種量3%，發酵5 d對二次發酵芥菜感官品質的影響，結果見表3。

由表3可知，隨著植物乳桿菌Lact.5接種量的增加，芥菜感官品質與鹽漬芥菜感官品質（25.7分）相比較，都有不同程度的提升，其中氣味的提升程度最大，而色澤和滋味的提升較次，質地方面幾乎沒有變化；接種量＞3%的感官總分區別不明顯，這可能是因為隨著Lact.5接種量的增加，發酵速度加快，發酵結束也加快，芥菜腌制成熟了，所以感官上沒有太大的變化，選取2%～4%的接種量為正交試驗的水平。

2.2 短乳桿菌Lact.2接種量對二次發酵芥菜感官品質的影響采用1.3.1節人工接種二次發酵芥菜加工工藝，接種短乳桿菌Lact.2（1%、2%、3%、4%、5%），植物乳桿菌Lact.5接種量3%，發酵5 d對二次發酵芥菜感官品質的影響，結果見表4。由表4可知，短乳桿菌Lact.2不同接種量對二次發酵芥菜的感官品質與鹽漬芥菜感官品質（25.7分）相比較，都有不同程度的提升，也是氣味的提升程度最大，色澤和滋味上的提升較次，質地方面幾乎沒有變化；短乳桿菌Lact.2接種量＞3%，發酵芥菜的感官總分區別不大，選擇2%～4%的短乳桿菌Lact.2接種量為正交試驗的水平。

另外從表3、表4的結果還可以看出，人工接種乳酸菌二次發酵對芥菜的感官品質都有提升，氣味的提升可能是微生物發酵作用導致酯類等香氣物質增加，色澤的提升可能是微生物發酵使得芥菜變酸，各種色素類物質在酸性條件下褪去所致，而滋味的產生可能是微生物發酵作用使得呈味氨基酸與有機酸的成分更為復雜所致；另外，植物乳桿菌Lact.5的發酵效果要優于短乳桿菌Lact.2，有很多文獻[10-12]表明在腌菜與泡菜的中后期發酵中，植物乳桿菌是優勢菌體。

2.3 發酵時間對二次發酵芥菜感官品質的影響

采用1.3.1節人工接種二次發酵芥菜加工工藝，接種植物乳桿菌Lact.5和短乳桿菌Lact.2各3%，發酵（3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）對二次發酵芥菜感官品質的影響，結果見表5。由表5可知，人工接種二次發酵芥菜的感官品質與鹽漬芥菜感官品質（25.7分）相比較，都有不同程度的提升，隨著發酵時間的延長，芥菜的感官評分是先增加，到了7d以后感官評分變化不大，根據此單因素的結果可以看出5 d、6 d、7 d的發酵效果是最好的，但是考慮到發酵時間的延長提高了生產成本，所以選取發酵時間4～6 d作為正交試驗的水平。

2.4 腌漬芥菜人工接種二次發酵工藝優化正交試驗結果

在單因素試驗基礎上，采用1.3.1節人工接種二次發酵芥菜加工工藝，對腌漬芥菜人工接種二次發酵工藝優化，結果與分析見表6，方差分析見表7。

由表6可知，各因素對腌制芥菜感官評分影響的主次順序為植物乳桿菌接種量＞短乳桿菌接種量＞發酵時間，多菌種人工接種二次發酵芥菜工藝的最優條件為A3B3C3，即植物乳桿菌接種量為4%，短乳桿菌接種量為4%，發酵時間為6 d。在此最佳發酵工藝下，腌制芥菜感官評分為32.5分。

由表7可知，因素A、因素B的P值＜0.05，因素C的P值＞0.05，表明植物乳桿菌和短乳桿菌添加量對結果的影響程度差異顯著，發酵時間對結果影響程度差異不顯著。

2.5 發酵芥菜揮發性成分分析結果

腌漬芥菜、自然二次發酵和人工接種二次發酵芥菜的揮發性成分GC-MS分析的總離子流色譜圖見圖1，各成分的鑒定結果見表8。

由表8可知，烷烴類、烯烴類、炔烴、芳香烴和雜環類物質都不是蔬菜中的主要風味物質[13]，且相對含量較低。樣品1共檢出揮發成分89種，總含量71.81%，其中醛類12種（7.78%），酮類7種（3.21%），醇類7種（3.65%），酸類8種（5.82%），醚類3種（10.70%），酚類1種（0.28%），含氮類4種（2.38%），酯類物質29種（30.96%），硫醇1種（0.11%）；樣品2共檢出揮發成分95種，總含量69.26%，其中醛類14種（7.39%），酮類11種（4.83%），醇類9種（11.06%），酸類6種（2.08%），醚類3種（4.18%），酚類2種（0.31%），含氮類3種（1..67%），酯類物質30種（31.47%）；樣品3共檢出揮發成分93種，總含量79.45%，其中醛類11種（7.10%），酮類6種（3.40%），醇類12種（13.54%），酸類6種（1.96%），醚類2種（5.02%），酚類1種（0.26%），含氮類3種（1.84%），酯類物質27種（38.11%）。

從各類化合物對比來看，醛類物質中，3個樣品的種類和含量區別不大，樣品1與樣品2共有成分有9個，樣品1與樣品3共有成分有7個，樣品2與樣品3共有成分有9個，其中糠醛的含量較高。酮類物質中，樣品2的種類和含量最多，其余2個都差不多，3,4,4a,5,6,7-六氫-1,1,4a-三甲基-2（H）-萘酮的含量很高，它是茶香螺烷的一種同分異構體。醇類物質中，樣品1的種類和含量最少，樣品2和樣品3相對較多，這可能是后續的發酵中，微生物代謝所生產的。酸類物質中，樣品2、3的區別不大，樣品1中較多，其中庚酸的含量有2.69%比其他的揮發酸類含量高很多，只存在于樣品1中。醚類物質中，二甲基二硫醚、二甲基三硫醚的含量都很高，含硫類的物質是酸菜中重要的風味物質[14]。酚類物質和含氮物質的差別在3個樣品中都不明顯，3個樣品中苯代丙腈的含量比較高，這也是酸菜中的重要風味物質。酯類物質中，3個樣品的含量和種類都是酸菜中最多的，都在總物質含量的30%以上，這也證明了酯類物質是腌漬芥菜中最重要的揮發性物質，其中異硫氰酸丙烯酯的含量最高，異硫氰酸酯類物質一般都具有強烈的催淚性刺激辛香味，它是十字花科類植物中的辛辣風味物質[15]，在酯類物質這一最重要物質的含量上人工接種二次發酵芥菜達到了38.11%，很大程度上高于自然二次發酵芥菜含量31.47%和腌漬芥菜30.96%，并且特征風味物質異硫氰酸酯的含量也高于其他2個，這可能是人工接種二次發酵芥菜香氣要好于自然二次發酵芥菜和腌漬芥菜的原因。

通過樣品的感官評分可知，樣品3（32.5分）＞樣品2（26.2分）＞樣品1（25.7分），產酸方面，樣品3和樣品2的總酸含量都達到了0.94%，并且繼續發酵總酸含量不再增加，這也說明了總酸含量0.94%是芥菜發酵產酸的終點，樣品3達到這個終點的時間只需要5 d，樣品2需要7 d。這也說明了人工接種二次發酵芥菜能提高工業上腌漬芥菜的品質，并且和自然二次發酵芥菜比起來，產品品質更優越，發酵時間更短。

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗優化了人工接種二次發酵芥菜的生產工藝，優化工藝是：在室溫條件下，分別接種植物乳桿菌和短乳桿菌各4%，發酵時間6 d，產品的綜合感官評分達到32.5分。

通過GC-MS分析，腌漬芥菜共檢測出揮發性成分89種物質，總含量71.81%，自然二次發酵芥菜共檢測出揮發性成分95種物質，總含量69.26%，優化工藝人工接種二次發酵芥菜共檢測出揮發性成分93種物質，總含量79.45%。結果表明，腌漬芥菜的揮發性物質種類經過二次發酵有所增加，人工接種二次發酵的腌漬芥菜揮發性物質的總含量最高。

目前工業上的腌漬芥菜風味物質的形成不夠完全，加工過程中風味物質還會損失，且總酸（以乳酸計）含量只能達到0.3%～0.6%，需要人工添加乳酸來滿足人們對酸菜酸味的要求。利用人工接種乳酸菌在低鹽的條件下第二次發酵芥菜可以有效的解決這些問題，人工接種二次發酵芥菜具有產品感官品質好、發酵速度快、酸度達標且酸味比單一添加的乳酸更好，人工接種二次發酵應用于工業化生產是一種可行的辦法。

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CHAO Yuzhou1,2,DENG Fangming1,2*
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China)

In order to improve the flavor of pickled mustard,the artificial inoculation secondary fermentation technology of the pickled mustard was optimized by single factor and orthogonal test.Results showed that the optimal technology wasLactobacillus plantaruminoculum 4%,L.brevisinoculum 4%,fermentation time 6 d,room temperature.Under these conditions,the comprehensive sensory score of the product reached 32.5.The volatile components of pickled mustard,natural secondary fermented pickled mustard and optimal secondary fermented pickled mustard was analyzed by GC-MS.The detection results showed that 89 volatile compounds were detected in pickled mustard,and the total content was 71.81%;95 volatile compounds were detected in natural second fermented pickled mustard,and the total content was 69.26%;93 volatile compounds were detected in the artificial inoculation second fermented pickled mustard,and the total content was 79.45%.The species of volatile components of the pickled mustard increased slightly after second fermentation,and the total volatile components content of the optimal second fermented pickled mustard was the highest.

pickled mustard;fermentation;orthogonal test;volatile compounds

TS255.53

A

0254-5071（2015）04-0035-07

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.009

2015-03-15

公益性行業（農業）科研專項（201403079）；湖南省現代農業蔬菜產業技術體系專項（2012278）

巢雨舟（1989-），男，碩士研究生，研究方向為食物資源開發與利用。

*通訊作者：鄧放明（1962-），男，教授，博士，研究方向為食品科學與工程。