HPLC法檢測分析溫度對中藥口服液品質的影響

李沙，郭棟，王曉雯，朱萬軍，羅立新*

（1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510006；2.無限極（中國）有限公司，廣東江門529156）

HPLC法檢測分析溫度對中藥口服液品質的影響

李沙1，郭棟2，王曉雯1，朱萬軍2，羅立新1*

（1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510006；2.無限極（中國）有限公司，廣東江門529156）

運用高效液相色譜法（HPLC）比較分析了正常、異常中藥（TCM）口服液中美拉德反應產物組成及其對中藥口服液質量的影響。結果表明，異常樣品的還原糖、蛋白質含量、美拉德反應中間產物糠氨酸、糠醛、5-羥甲基糠醛和丙烯酰胺以及氨基酸含量如賴氨酸、甘氨酸、亮氨酸等均比正常樣品偏高。采用不同溫度處理提取的類黑素的黑化程度隨加熱溫度的升高而增強。美拉德反應程度隨樣品烘干溫度的升高而增加，高溫處理不利于中藥口服液樣品的安全性。

中藥；高效液相色譜；美拉德反應產物；類黑素；5-羥甲基糠醛

中藥（traditional Chinese medicine，TCM）口服液是在中藥湯劑基礎上發展起來的，既保持了原有湯劑的固有特色又具有發揮療效較快、攜帶方便、作用明顯、保存性能良好等優點，因此近年來深受廣大生產商的青睞，使得中藥口服液的品種發展較多也較快。

美拉德反應（Maillard reaction）按其本質而言是指羰基化合物和氨基化合物之間發生的縮合反應。在中藥及食品中反應物通常是還原糖、氨基酸、蛋白質和肽類，是食品以及中藥口服液中香味產生的主要來源之一[1]。幾乎所有含有羰基和氨基的食品及中藥材料在加熱條件下均能產生Maillard反應[2]。Maillard反應產物與反應溫度、時間、pH值、溶劑等有重要關系，也與參與反應的氨基酸、蛋白質、糖等有很大關系。在Maillard反應過程中有很多重要的產物形成，并能賦予中藥口服液獨特的風味和色澤[3]。所以，對于中藥口服液的Maillard反應產物的研究已成為必然趨勢。而運用高效液相色譜的方法檢測Maillard反應的主要中間產物是現在較為高效準確的方法之一[4]。

5-羥甲基糠醛是葡萄糖或果糖等單糖化合物在高溫或酸性條件下，催化脫水產生的一種醛類化合物，是美拉德反應的重要中間產物[3，5-6]；糠氨酸是美拉德反應生產的特定產物，近年來，糠氨酸常被用作判斷食品受熱程度的指標，在蛋類、谷物、乳制品、肉制品、中藥口服液中均有應用[7]。糠醛是美拉德反應中還原糖和氨基酸或蛋白質中的自由氨基縮合生成的席夫堿經過一系列的反應而產生的美拉德中間產物[3]。類黑素是指Maillard反應后期形成的呈棕褐色的物質，它是一類聚合度不等、結構復雜的高分子聚合物混合體[8-9]。丙烯酰胺是一種具有神經毒性的潛在致癌物質，長期食入過量的丙烯酰胺可損害遺傳物質并導致基因損傷，最后誘發癌變，現已被國際癌癥研究中心（international agency for research on cancer，IRAC）列為ⅡA類致癌物[10-11]。它在美拉德反應中主要是由天門冬酰胺與還原性糖反應產生。在中藥口服液的制作過程中往往因為加熱溫度過高而使得成品中出現黑色小顆粒狀沉淀，發生這種情況主要是由于高溫加熱富含蛋白質、氨基酸及還原糖的中藥原材料產生的美拉德反應產物發生了一系列復雜反應所造成的。本研究主要是利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測分析兩種不同溫度烘干的中藥口服液樣品中的主要美拉德反應中間產物：游離氨基酸、糠氨酸、糠醛、5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF），并且對食品及藥品較關注的具有神經毒性的潛在致癌物質丙烯酰胺進行含量測定；利用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法測定還原糖含量以及使用福林-酚（Folin-Ciocalteu）法測定蛋白質含量，并且對中藥樣品中的Maillard反應終產物類黑素進行提取并用不同溫度、不同時間來處理類黑素，同時觀察其外觀品質變化情況。目的是控制中藥口服液制作過程中溫度及檢測Maillard反應產物，對中藥口服液的品質保證和食用安全性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正常和異常中藥口服液樣品：廣東某醫藥公司。

糠氨酸標準品：法國NeoMPS公司；羥甲基糠醛標準品、糠醛標準品、丙烯酰胺標準品：上海生化試劑公司；18種氨基酸混合標準液（貨號：AAS18-5ML）、牛血清蛋白：美國Sigma公司；四氫呋喃（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、三乙胺（化學純）：天津科密歐有限公司；異硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）：阿拉丁公司；葡萄糖、三水醋酸鈉：天津市大茂化學試劑廠；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Waters-2695高效液相色譜儀、UV2489紫外檢測器：美國Waters公司；AgilentC18色譜柱：美國安捷倫公司；3K30型高速冷凍離心機：德國SIGMA公司；CARY50紫外-可見分光光度計：上海魁元科學儀器有限公司；ALPHA1-4真空冷凍干燥機：德國CHRiST公司；Thermo Forma 902超低溫冰箱：美國Thermo Forma公司；HK-35AS恒溫干燥箱：武漢科創機械設備責任有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準品及樣品的制備

（1）分別取同一批次生產的3瓶正常樣品編號：正1、正2、正3。取同一批次生產的3瓶異常樣品編號：異1、異2、異3。每一瓶樣品分析均做3個平行。正常樣品的烘干條件為118～120℃高溫高壓蒸汽殺菌30 min，40～50℃烘干14 h。異常樣品的烘干條件為118～120℃高溫高壓蒸汽殺菌30 min，90～100℃烘干1 h。正常樣品底部只出現褐色沉淀，而異常樣品底部還出現了黑色小顆粒狀沉淀，且外觀色澤更深。

（2）將樣品10 000 r/min離心5 min取100 μL上清液于干燥管中加入20 μL的0.02 mol/mL正亮氨酸作為內標物，真空冷凍干燥。將20 μL的氨基酸標準品（標準品中的氨基酸均以2.5 μmol/mL濃度溶于0.1 mol/mL HCl溶液，但L-胱氨酸濃度為1.25 μmol/mL）置于干燥管中并分別加入20 μL的0.02 mol/mL正亮氨酸作為內標物，真空冷凍干燥。

（3）向干燥管中加入干燥劑（乙醇∶水∶三乙胺=2∶2∶1，V/V）的溶液200 μL，真空冷凍干燥，重復上述操作一次。

（4）加入200 μL衍生劑（乙醇∶三乙胺∶水∶PITC=7∶1∶1∶1，V/V），室溫放置20 min使PITC與樣品中的氨基酸充分反應生成胺甲酰基氨基酸（PITC-AA）。

（5）真空冷凍干燥后于-20℃冰箱放置儲存，樣品進樣前用0.1 mol/mL的HCl溶解并用初始流動相（即95%A+ 5%B）稀釋進樣。

1.3.2 還原糖及蛋白質含量的測定

還原糖按照國標GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》中的3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定[12]。蛋白質按照福林-酚（Folin-Ciocalteu）法測定[13]。

1.3.3 類黑素的提取及處理

采用有機溶劑沉淀法提取類黑素[14]：先取10 mL樣品加17.5 mL無水乙醇離心收集沉淀，再往上清中加入等體積丙酮并離心收集沉淀，然后把兩次得到的沉淀加水溶解，最后重復用無水乙醇和丙酮沉淀得到類黑素。分別將正常及異常樣品的類黑素分成6份，其中3份正常樣品和3份異常樣品分別置于6個培養皿中，另外6份樣品分別加1 mL超純水混勻置于50 mL離心管中。分別將置于培養皿及離心管中正常及異常樣品于100℃的烘箱處理1 h、70℃烘箱處理2 h、50℃烘箱處理14 h。

1.3.4 HPLC檢測樣品中的游離氨基酸、5-羥甲基糠醛、糠

氨酸、丙烯酰胺及糠醛的含量

PITC柱前衍生法結合內標法用高效液相色譜方法測樣品中的游離氨基酸[15]。

色譜條件：色譜柱AgilentC18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測器：UV2489紫外檢測器；檢測波長254 nm；流動相A相20 mmol/L三水醋酸鈉（pH=7.2±0.05）+0.5%四氫呋喃；B相20 mmol/L三水醋酸鈉（pH=7.2±0.05）∶甲醇∶乙腈=1∶2∶2；流速1 mL/min；進樣量10 μL；溫度38℃。梯度洗脫程序見表1。

外標法同時測定樣品中的5-羥甲基糠醛（5-HMF）、糠氨酸、丙烯酰胺[16]。

色譜條件：色譜柱Agilent C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測器：UV2489紫外檢測器；檢測波長：280 nm；流動相為：0.1%乙酸-100%乙腈=85∶15（V/V）；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；溫度：30℃；等度洗脫。

標準品和樣品的制備及處理：稱量需要的標準品，然后樣品與標準品均用流動相稀釋（100 μL的標準品/樣品+ 900μL流動相），標準品直接用0.22 μm的濾膜過濾待測，樣品8 000 r/min離心2 min，取上清，然后用0.22 μm的濾膜過濾待測。

外標法測定樣品中的糠醛的含量[17]。

色譜條件：色譜柱Agilent C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測器：UV2489紫外檢測器；檢測波長275 nm；流動相100%甲醇∶水=70∶30（V/V）；流速1 mL/min；進樣量：10 μL；溫度30℃；等度洗脫。

標準品和樣品的制備及處理：稱量需要的標準品，然后樣品與標準品均用流動相稀釋（100 μL的標準品/樣品+ 900μL流動相），標準品直接用0.22 μm的濾膜過濾待測，樣品8 000 r/min離心2 min，取上清，然后用0.22 μm的濾膜過濾待測。

2 結果和分析

2.1 還原糖、蛋白質含量測定結果

葡萄糖、牛血清蛋白標準曲線如圖1所示。由圖1可知，在所測質量濃度范圍內，葡萄糖質量濃度和牛血清蛋白質量濃度與吸光度值均呈正比。葡萄糖標準曲線的回歸方程為y=2.047x+0.155 9，相關系數R2為0.996 7；牛血清蛋白標準曲線回歸方程為y=1.043 9x+0.008 1，相關系數R2為0.997 3，表明在測定范圍內顯色靈敏、穩定且成良好線性。

樣品中的還原糖、蛋白質含量測定結果如圖2所示。由圖2A可知，異常樣品的還原糖含量明顯比正常樣品的高，正常樣品還原糖含量在6.5 g/100 mL左右，而異常樣品的還原糖含量＞6.7 g/100 mL。由圖2B可知，異常樣品的蛋白質含量也比正常樣品的略高（異2除外）都接近3 g/100 mL，與富含蛋白質的牛奶樣品中蛋白質含量基本一致[18]。如果蛋白質含量較高，樣品在進行加熱處理后很有可能導致游離氨基酸含量較高。從實驗結果可知高溫短時間處理會使得中藥樣品的原材料更好的分解成還原糖和蛋白質，從而使得異常樣品中的還原糖和蛋白質含量相對正常樣品略高。樣品中較高的還原糖和較高的蛋白質或者游離氨基酸在適宜的條件下就極易發生美拉德反應，從而產生美拉德反應中間產物及最終產物。

2.2 類黑素的提取及在不同溫度和時間條件下處理結果

正常樣品和異常樣品提取的類黑素在未經過高溫處理的情況下以及兩種樣品置于平板中和試管中的類黑素經過不同溫度、不同時間烘干處理后的外觀顏色變化如圖3所示。由圖3可知，類黑素在100℃處理1 h嚴重變黑，而在70℃處理2 h也會變黑，但變黑程度卻沒有100℃明顯。但是，類黑素在50℃條件下處理14 h后依然未明顯變黑。并且，對比A、B和E、F中的1明顯可以看出100℃處理1 h平板中的褐色類黑素固體變為黑色顆粒固體物質，對比C、D中的1和3可知，100℃處理1 h的試管中的類黑素雖然發黑但由于其懸浮在液體中，只能看出樣品由原本的棕褐色液體變成黑色液體。結果表明，類黑素會因為處理溫度過高而發生黑化反應，且無論是培養皿中的類黑素還是含水的試管中的類黑素都是隨著處理溫度的升高，其變黑的程度加劇。因此，高溫條件下劇烈的美拉德反應后產生的大量類黑素在高溫處理條件發生了黑化反應不僅會使中藥口服液的液體呈現出黑色而且嚴重時會出現黑色顆粒狀物質。所以，對于可發生劇烈美拉德反應而產生大量類黑素的樣品在后期烘干處理時應該考慮采用適宜的溫度來烘干外表水分。

2.3 HPLC檢測游離氨基酸及美拉德反應中間產物的結果

2.3.1 樣品中游離氨基酸的檢測結果

按照實驗條件中的色譜條件，將處理好的樣品溶液進行高效液相色譜分析，得到色譜圖，再對所得的結果進行計算分析如表2所示。由表2可知，異常樣品中的賴氨酸和甘氨酸含量明顯比正常樣品高，而多數正常樣品的半胱氨酸含量較異常樣品的高。賴氨酸最易于發生美拉德反應可獲得更深的色澤。而且在美拉德反應中甘氨酸含量增加時，色素形成迅速增加。但是，半胱氨酸反應后獲得色澤最淺。異常樣品中增色較強的物質如賴氨酸、甘氨酸含量都比正常樣品的高；增色較弱的半胱氨酸含量較正常樣品低，增色強的氨基酸多而增色較弱的氨基酸略少，從而增色效果相對更為顯著。這也是異常樣品顏色比正常樣品更深的原因。除此之外，其他易于發生美拉德反應的氨基酸（如天冬氨酸、精氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸等）在多數異常樣品中的含量都明顯比正常樣品高。因此，結果表明隨著烘干處理樣品的溫度升高，樣品中的大多數游離氨基酸含量在整體水平上也隨之增加。

2.3.2 5-HMF、糠氨酸和糠醛的檢測結果

高效液相色譜檢測樣品中美拉德反應中間產物的含量如表3所示。由表3可知，異常樣品的美拉德反應中間產物糠氨酸、糠醛和5-羥甲基糠醛均比正常樣品偏高。這說明異常樣品中的美拉德反應比正常樣品中的劇烈，從而表明異常樣品產生的美拉德反應最終產物類黑素也比正常樣品的高，并經過高溫烘干過程使得類黑素黑化程度加深，這可能是中藥口服液出現黑色沉淀的原因，同樣也說明烘焙溫度影響美拉德反應發生程度，從而影響重要中藥口服液質量。

2.3.3 美拉德反應不利中間產物丙烯酰胺的檢測結果

丙烯酰胺形成的最佳溫度為140～180℃，并在一定的范圍內，隨著溫度的增加丙烯酰胺生成量也在逐漸增加，即在一定范圍內丙烯酰胺的生成量與溫度成正比[19]。而中藥口服液的制作原材料主要是由低脂肪、高碳水化合物的植物類構成，因此在高溫條件下也能形成丙烯酰胺這種有害的美拉德中間產物。

樣品中的丙烯酰胺含量結果如圖4所示。由圖4可知，正常樣品中的丙烯酰胺含量明顯低于異常樣品，這就說明高溫處理會使得中藥樣品美拉德反應中間產物丙烯酰胺含量明顯增加，從而影響產品品質及安全。因此，適當控制美拉德反應的溫度，才能更好保證中藥口服液的風味和品質，并提高其安全性。

3 結論

本研究比較分析了不同烘焙溫度對中藥口服液中美拉德反應產物生成的影響。結果表明，高溫烘焙條件下均會增加還原糖、蛋白質含量、氨基酸含量以及美拉德中間產物糠氨酸、糠醛、5-羥甲基糠醛和丙烯酰胺含量，美拉德反應程度隨樣品烘干溫度升高而增加。高溫烘干處理不利于中藥口服液樣品的安全性。從實驗結果及樣品外觀呈現綜合而言，樣品烘干溫度50℃較100℃更為適合中藥口服液的產品品質及安全性。因此，在中藥口服液的生產過程中，選擇適宜的溫度對控制美拉德反應程度至關重要，進而可以有效控制美拉德反應不利中間產物的量。但是，50℃的烘干處理溫度在工業應用中所需的烘干時間太長，從工業生產成本方面來說更適合的烘干處理溫度有待進一步研究，此外，美拉德反應程度及產物除了與反應溫度有關外，還與時間、pH值、溶劑、原材料等有重要關系。所以，其他的影響因素對美拉德反應程度及產物的影響，也有待于深入研究。

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LI Sha1,GUO Dong2,WANG Xiaowen1,ZHU Wanjun2,LUO Lixin1*
(1.School of Bioscience and Bioengineering,South China University of Technology,Guangzhou 510006,China; 2.Infinitus(China)Co.,Ltd.,Jiangmen,529156,China)

The compounds produced by Maillard reaction in normal and abnormal oral liquid of traditional Chinese medicine(TCM)were analyzed by HPLC,and their effects on oral liquid quality were evaluated.The results showed that the contents of reducing sugar,protein,Maillard reaction products including furosine,furfural,5-hydroxymethylfurfural and acrylamide;as well as the contents of amino acids such as lysine,glycine and leucine in abnormal samples were all obviously higher than in normal samples.The melanization degree of melanoid extracted by different temperature strengthened with the increase of temperature.The degree of Maillard reaction also increased with a rise of drying temperature,therefore,high temperature is not conductive to the safety of the oral liquid of TCM.

traditional Chinese medicine;HPLC;Maillard reaction products;melanoid;5-hydroxymethyl-furfural

TS262.5

A

0254-5071（2015）04-0030-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.008

2015-03-20

國家自然科學基金資助項目（31271924）

李沙（1988-），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物檢測。

*通訊作者：羅立新（1966-），教授，博士，研究方向為微生物學及發酵。