豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法的研究進展

孫明潭，袁萬哲，2，孫繼國，2

（1.河北農業大學動物醫學院，河北 保定 071001；2.河北省獸醫生物技術工程技術研究中心，河北 保定 071001）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種豬繁殖障礙和呼吸道癥狀的傳染病，又稱豬藍耳病。PRRS的傳播速度非常快，我國各省相繼報道PRRS的發生，并分離到毒株。2006年春、夏季首次暴發由高致病性PRRSV引起的“豬無名高熱癥”，給我國養豬業造成了重大的經濟損失。

我國將PRRS列為二類傳染病，高致病性豬藍耳病列為一類傳染病。包括我國在內的世界各國都投入大量的人力物力對該病進行研究，但是對其致病機制和自身復制機制還未能完全明確。因此，快速準確的檢測該病顯得尤為重要。目前檢測的技術手段有：病毒分離（VI），血清學檢測，分子生物學檢測等方法。本文就PRRSV主要檢測技術的最新研究進展作一綜述。

1 臨床診斷

感染PRRSV的豬群會有不同的臨床癥狀,母豬：發熱、厭食、沉郁、昏睡，呼吸困難、咳嗽；流產、死胎、弱仔或早產；產仔率降低、推遲發情、屢配不孕或不發情等，產后無乳等癥狀。育成豬：雙眼腫脹、結膜炎，有眼屎或膿性分泌物，并出現呼吸困難，耳尖發紫、沉郁、昏睡等癥狀。公豬：感染后表現咳嗽、精神沉郁、食欲不振、呼吸急促，暫時性精液減少和活力下降。仔豬：以1月齡內仔豬最易感染，體溫可達40℃以上，呼吸困難、有時腹式呼吸，厭食，腹瀉，耳尖至耳根皮膚發紺，出現神經癥狀，如肌肉震顫，呆立，前肢伸開呈八字腳，運動失調，后肢麻痹，眼瞼水腫，死亡率高達80%。對于感染高致病性豬藍耳病的豬群，多突然發病，且傳播迅速。

在病理變化上，藍耳病會呈現典型的間質性肺炎，腎臟淤血、腫大，病死豬全身淋巴結充血、水腫，脾臟腫大、有出血性丘疹。目前豬群中疾病多為混合感染，僅根據臨床癥狀和剖檢很難確診，因此仍需實驗室方法做出最終診斷。

2 實驗室診斷

2.1 病毒分離 病毒分離是PRRS最為確切的實驗室診斷方法。根據發病豬的生長階段，病料應選取死胎和發病仔豬的肺、腦、脾、淋巴結、血液等組織勻漿的混合物，母豬的血液，公豬的精液。PRRSV對溫度和pH值敏感，因此選取病毒含量高的病料并注意保存和及時送檢成為病毒分離的關鍵。

目前用于分離PRRSV的細胞有：豬原代肺泡巨噬細胞（PAM）、CL-2621、猴腎細胞系Marc-145或MA104。目前主要應用Marc-145進行病毒分離，高致病性PRRSV和部分經典毒株初次分離即可適應Marc-145細胞產生細胞病變（CPE）。而有些經典毒株需先適應PAM之后，才能適應Marc-145細胞，并且不易產生細胞病變（CPE）。因此，在進行病毒分離的同時，還應結合其他實驗室方法進行鑒定。并且病毒分離費時費力，因而不能成為普遍應用的方法。

2.2 血清學技術

2.2.1 免疫過氧化物酶細胞單層試驗（IPMA）與間接熒光抗體試驗（IFA） IPMA需在PAM、Marc-145、CL2621等敏感細胞上進行，特異性和敏感性較好，可以用于PRRSV抗原檢測、病毒鑒定、血清抗體檢測。但IPMA需配備專門技術人員和相關儀器設備，結果判定受主觀因素影響較大，易出假陽性。IFA與IPMA方法基本相似，因此這兩種方法沒有廣泛的應用于臨床。

2.2.2 中和試驗（VN） VN使用Marc-145細胞在96孔微量板上進行，其特異性較高，可以區分不同病毒類型和確定病毒滴度。由于PRRSV特異性中和抗體產生較晚，導致VN敏感性較低，因此不適宜PRRS早期檢測，常用于科研工作中。

2.2.3 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） ELISA特異性和敏感性高，具有操作簡單、標準化、快速、經濟、結果判斷客觀、適宜大規模檢測等特點，現已廣泛應用，并且在許多國家成為標準或法定的診斷方法。

目前PRRSV常用N蛋白和GP5蛋白作為診斷抗原，為建立多種ELISA的檢測方法。其中以GP5蛋白作為診斷抗原不僅能檢測野毒感染，而且可以彌補N蛋白作為抗原不能反映機體免疫狀況的缺陷[1]。同時，國內外學者相繼應用Nsp2、Nsp7、Nsp9等非結構蛋白建立了ELISA檢測方法；隨著唾液檢測技術的發展，國外學者也相繼建立了可以檢測唾液中PRRSV抗體的ELISA方法，尤其IgG抗體檢測方法已被廣泛應用[2]。

2.2.4 膠體金免疫層析方法（GICA） GICA是20世紀90年代發展起來的一種檢測診斷技術。Cui等應用膠體金標記重組M、N蛋白作為捕獲蛋白，建立了膠體金抗體檢測技術，顯示了較好的特異性和敏感性[3]。Zhou等針對N蛋白的單克隆抗體D5和M蛋白的單克隆抗體E9用膠體金標記，制備了膠體金試紙條，與RT-PCR檢測結果相比，特異性、敏感性及檢出準確性的符合率達93%以上[4]。膠體金試紙條操作簡便、快速，結果判定明顯、直觀，非常適宜基層現場使用，但該方法在技術上還有待突破。

2.2.5 熒光微珠免疫檢測方法（FMIA） FMIA是基于Luminex技術建立的檢測方法，目前國外學者研究較多，并被應用到多種病毒的檢測診斷中。Langenhorst等將重組Nsp7蛋白和N蛋白共價偶聯到Luminex熒光微球上，建立的熒光微珠免疫檢測方法可以檢測豬唾液和血清中PRRSV抗體，其特異性和敏感性均高于90%[5]。Gerber等應用FMIA與IDEXX公司ELISA試劑盒檢測同樣的樣品，結果顯示兩個方法的特異性和敏感性無顯著差異[6]。FMIA可以檢測大量樣品和多種抗體，對病毒的混合感染、疫苗免疫效果、野毒株的鑒別診斷及快速診斷方面有重要的應用意義。

2.3 分子生物學技術

2.3.1 RT-PCR檢測 在傳統RT-PCR的基礎上，國內外學者相繼建立了多種RT-PCR方法。Liu等建立的3重PCR能夠快速鑒別檢測CSFV、PCV-2、PRRSV3種豬繁殖與呼吸衰竭病毒，具有較高的靈敏度[7]。鄭明等通過反向PCR擴增2對特異性探針標記的報告基因，建立了PRRSV環介導間接PCR檢測方法，可對高、低致病性PRRSV進行鑒別診斷[8]。由于該方法特異性高、檢測速度快、多種病原同時檢測、避免散毒等特點，在PRRS群體的檢測上意義重大。

2.3.2 實時熒光定量PCR（real-time PCR） 近幾年，實時熒光定量PCR廣泛應用于PRRSV的診斷中。Chai等建立了基于SYBR Green的real-time PCR，最低檢出量為1 TCID50/0.1 mL[9]。Wernike等成功引入基于異源RNA的內部控制后，建立了多重real-time RT-PCR，可以鑒別診斷美洲型、歐洲型以及高致病性PRRSV[10]。由于實時熒光定量PCR可以實時檢測核酸擴增并能自動分析，從而能避免擴增產物污染和不定量的問題。該方法特異性高、敏感性好、操作簡單快速，目前成為應用于實驗室診斷PRRSV的首選方法之一。

2.3.3 逆轉錄環介導等溫擴增技術（RT-LAMP）

RT-LAMP原理為核酸鏈通過在等溫環境條件下的循環置換擴增，實現對靶序列的放大。Zhang等建立的RT-LAMP檢測方法，樣品檢測結果與病毒分離結果符合率為100%，與CSFV、PRV、PCV-2、SIV等均無交叉反應[11]。GAO等根據M基因序列設計特異性引物建立了RT-LAMP檢測方法，其檢測的敏感性高于常規RT-PCR和real-time RTPCR[12]。RT-LAMP方法具有特異性強、敏感性高、無需貴重設備就能滿足反應條件、檢測快速簡便等特點，在PRRSV檢測診斷中應用越來越廣泛。

2.3.4 原位雜交技術（ISH） 原位雜交技術主要采用地高辛、生物素等標記材料插入PRRSV的基因中制成特異性探針，可用于檢測發病豬的肺臟、淋巴結等含有病毒的組織。Han等用ISH方法檢測感染歐洲PRRSV的豬組織，結果證明，接種美洲型疫苗的母豬也能感染歐洲型PRRSV，并導致繁殖障礙[13]。原位雜交技術為PRRSV的檢測提供了新的途徑，但由于成本較高，目前還未大規模應用。

2.3.5 基因芯片技術（Gene chip technology） 該技術主要用于基因序列測定、基因表達譜鑒定、基因突變體的檢測分析和基因組的功能研究等方面，是近幾年新興的一項技術，并應用于PRRSV的檢測。Xing等利用Affymetrix公司的基因芯片檢測樣品，與real-time RT-PCR結果一致[14]。基因芯片技術可以進行大規模高通量的檢測，雖然目前應用成本較高，但隨著研究的逐步深入，該技術將被廣泛應用。

3 展望

綜上所述，PRRSV檢測技術隨著PRRS的流行在逐步發展，早期建立的檢測方法隨著國內外學者的研究不斷改進和提高，同時新的檢測技術也不斷建立和應用。尤其針對PRRSV的高變異和疫苗株的鑒別診斷，為臨床的早期預防提供了重要參考。雖然每種檢測方法都有其局限性，但相信在以后的研究中會通過優化已有方法和應用新技術，建立全新的檢測方法，為預防PRRS的發生和消滅PRRSV提供重要技術支持。

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