三氧化二砷誘導線粒體途徑細胞凋亡機制的研究進展

李 丹 宋婷婷 劉偉華 謝坤霞 王晶晶 肖延風

西安交通大學第二附屬醫院兒科，西安 710004

三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）又名信石、砒霜等，1998年第一次報道其對于復發或難治性急性早幼粒細胞性白血病（acute promyelocytic leuketnia，APL）能達到誘導期完全緩解，并且無骨髓抑制作用[1]。此后，ATO 對于多種血液系統惡性腫瘤具有治療作用的報道越來越多，并且作為治療APL 的新藥先后通過了中國國家藥品監督管理局及美國FDA 的審批[2]。ATO可治療血液系統疾病，對多種惡性實體瘤也有強大的抗癌作用。許多化療藥物都是通過干涉腫瘤細胞的凋亡作用達到抗腫瘤的目的，ATO 作為一種已經使用幾個世紀的傳統藥物，也是通過誘導腫瘤細胞的凋亡來發揮作用的，但具體機制尚未明確，近年來ATO 和線粒體途徑凋亡信號通路的關系研究成為熱點，本文回顧了大量文獻，就此問題的研究進展進行闡述。

1 細胞凋亡

凋亡信號通路主要有3 類：線粒體途徑（內在通路，intrinsic pathway）、死亡受體途徑（外在通路，extrinsic pathway）和內質網途徑。在死亡受體途徑中，部分配體如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、Fas配體（也稱為CD95L）、TNF-相關的凋亡誘導配體或TNF配體超家族成員10（TNF SF10）分別與死亡受體1（TNF受體，TNFR1）、Fas（也稱CD95）、死亡受體4（DR4，也稱TRAIL 受體1）或DR5（也稱為TRAIL2）相互作用。這些相互作用最終導致Fas 關聯的死亡結構域（Fas associated death domain，FADD）的募集和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（Caspase 8）的活化。此后經過兩種途徑發揮凋亡作用，第一通過Caspase 信號通路傳遞凋亡信號；第二，線粒體膜電位的消失，線粒體膜通透性增高，細胞色素C 釋放，并與凋亡Caspase 活化因子（apoptotic protease activating factor，Apaf-1）、Caspase 9 前體及ATP/dATP 形成凋亡體，然后召集并激活Caspase 3，進而引發Caspase 級聯反應，導致細胞凋亡[3]。

內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）可啟動細胞凋亡。多種生理和病理條件，如缺氧、鈣離子平衡失調等，內質網內鈣離子平衡受到破壞，未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網累積，將會導致內質網內鈣離子失衡，增加了細胞內鈣離子濃度，觸發了細胞凋亡。

在線粒體途徑中，任何因素導致的ATP 降低、活性氧的產生及胞質內鈣離子濃度升高，均可使線粒體內膜腺苷轉位酶的構象發生改變，引起線粒體轉換孔的開放，使得線粒體跨膜電位降低或消失，細胞色素C 從線粒體膜間隙釋放出來，它同ATP/dATP 一起與Apaf-1、Caspase 9 前體相互作用形成凋亡小體，從而募集和活化Caspase 9，導致下游的Caspase 的活化和死亡應答[4]。在線粒體途徑中p53、Bcl-2 家族、凋亡抑制蛋白家族均為重要的細胞凋亡調節因子，NF-κB 通過對以上蛋白基因轉錄的調節間接地參與細胞凋亡的過程。

2 ATO 和細胞凋亡

ATO 是一種以線粒體為作用靶點的藥物，能夠結合腺苷核苷轉運蛋白，干擾線粒體的呼吸。與大多數的化療藥物一樣，其可以誘發線粒體凋亡通路。這條通路的特點為細胞色素C 的釋放及其他線粒體蛋白的釋放，集合及激活凋亡體，抑制凋亡抑制調節蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs），接下來激活Caspases 9 及其他的效應Caspase。ATO 潛在的毒性在于和腫瘤壞死因子家族的結合，激活外源性凋亡途徑。這條途徑由細胞因子綁定和激活死亡受體，形成Fas 關聯的死亡結構域的募集及Caspase 8 的裂分和活化下游的Capase 3。內質網應激誘發的凋亡通路和線粒體及死亡受體通路完全不同。ERS 激活信號級聯反應，同時激活其各自的信號傳導通路，觸發了未折疊蛋白效應（unfolding protein response，UPR）。過度的內質網應激損傷了內質網的功能，激活了凋亡信號通路。

3 ATO 與線粒體途徑誘發凋亡的關系

3.1 ATO 與活性氧的關系

活性氧化物指的是細胞內一類有活性的含氧物質。繼往文獻報道指出，ATO 可通過細胞膜彌散到細胞質中，通過產生活性氧類物質產生細胞毒性作用。也有報道指出，ATO 在白血病細胞系及其他實體腫瘤細胞系中均能產生氧化應激及細胞死亡。但具體機制尚未明確。Kumar 等[5]研究表明，在HL-60 細胞系中ATO 主要通過產生ROS、增加線粒體膜蛋白和脂質雙分子層過氧化反應、誘導DNA 損傷及減少還原型谷胱甘肽的濃度等途徑導致氧化應激，使得線粒體通透性增加，細胞色素C 從線粒體釋放，激活Caspase 系統產生細胞凋亡。Jiang 等[6]在對比ATO 和亞砷酸鹽在誘發A549 細胞系中氧化應激、基因毒性及細胞凋亡過程中的差別時發現，ATO 產生了更多的活性氧，超氧化物歧化酶濃度更低，細胞內還原性谷胱甘肽更低。故指出ATO 的誘發腫瘤細胞凋亡的機制中有活性氧的產生，其或許能解釋為何ATO 具有抗癌作用，二亞砷酸鹽卻具有致癌作用。

3.2 ATO 與BCL-2 家族

Bcl-2 家族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。促凋亡蛋白中，包含3 個BH 結構域（BH1，BH2，BH3）的Bak、Bok 和Bax，2 個BH 結構域的Bcl-Xs 以及只含有1 個BH 結構域的Bad、Bid、Bim、Bik、Hrk、Bnip3、Nix、Puma、Bmf、Noxa 等；另一類為抗凋亡蛋白，包含4 個BH 結構域（BH1、BH2、BH3 及BH4）的Bcl-2、Bcl-XL，Bcl-W、Al/Bfl-1、Boo 和含有3 個BH 結構域（BH1、BH2、BH3）的Mcl-1 等。這兩類蛋白的相互作用影響對方的功能。BCl-2 家族對線粒體膜通透性的改變至關重要，目前有三種假說解釋。①直接激活：Bcl-2 導致線粒體外膜通透性增加，在正常細胞中，BH3-only 家族蛋白無活性，或被家族中抗凋亡蛋白綁定而失去活性，當細胞接受凋亡信號后，BH3-only蛋白凋亡執行蛋白通過轉錄、翻譯或移位被激活，使其在線粒體外膜打孔，鈣離子外流，誘導細胞凋亡，此假說中抗凋亡蛋白通過直接綁定凋亡執行蛋白行使功能，而不是直接與Bak、Bax 結合起作用。②假定Bak、Bax 在胞漿內具有活性，與抗凋亡蛋白結合后，活性被抑制，接受凋亡刺激后，BH3-only 蛋白競爭性結合抗凋亡蛋白，使Bak、Bax 游離，發揮促凋亡活性。③接受凋亡信號后，BH3-only 凋亡蛋白與抗凋亡蛋白結合，中和其結合BH3-only 凋亡執行蛋白及Bak、Bax 的能力[7]。

線粒體外膜的通透性受多種因素的控制，包括Bcl-2 家族（促凋亡、抗凋亡蛋白），Bcl-2 蛋白的基因調節及翻譯后修飾能夠使腫瘤細胞免予凋亡。在濾泡性淋巴瘤中，Bcl-2 原癌基因轉移到免疫球蛋白重鏈的基因座上，導致了Bcl-2 轉錄的異常激活及高表達。除了基因的改變，經由生存前路徑如PI3K/Akt/mTOR或tRas/MEK/ERK 通路，能夠通過磷酸化調節Bcl-2家族蛋白的表達或活性[8]。

目前多項研究指出，ATO 誘導的腫瘤細胞凋亡途徑包括Bcl-2 的磷酸化、Caspase 2 的活化和聚合酶裂解片段有關，Bcl-2 的磷酸化導致了Bcl-2 和Bax異質二聚體的解離，并誘導產生Bax 和Bax 的異質二聚體產生，其可誘導促使線粒體釋放細胞色素C，細胞色素C 引發Caspase 級聯反應，促進了細胞的凋亡[9]。Ai 等[10]研究表明，應用ATO 處理膽囊癌細胞能夠誘發腫瘤細胞的凋亡，細胞調亡的程度與ATO 的濃度和作用時間有關，而且ATO 在mRNA 的水平可以下調Bcl-2 的表達；另外，應用ATO 處理過度表達Bcl-2蛋白的膽囊癌細胞后，凋亡細胞的數量會大量減少，表明Bcl-2 參與ATO 誘發的腫瘤細胞凋亡。ATO 還可以促進促凋亡蛋白Bax 表達增多，抑制抗凋亡Bcl-XL。Kim[11]等在正常的睪丸支持細胞中發現經過ATO處理后誘發了細胞的凋亡，且伴隨有Caspase 3 的活化，Bcl-2 及其他凋亡抑制蛋白下調，以及Bax 的上調。Zekri 等[12]從轉錄水平上也證實ATO 調高Bax 的水平，降低了Bcl-2、生存素等抗凋亡蛋白基因水平。Bcl-2 和Bax 之間的比例平衡，決定了細胞是凋亡還是存活的命運。綜上所述，ATO 通過調節Bcl-2 家族來誘發細胞的凋亡。

3.3 ATO 和p53

細胞的生長和死亡通常由原癌基因和腫瘤抑制基因的相互平衡決定。在許多腫瘤中均存在生存素的過渡表達和p53 功能的喪失。Shao 等[13]研究表明，生存素存在時，p53 的構象會發生直接變化，Zhang 等[14]研究表明，對于B 淋巴細胞型急性淋巴細胞白血病細胞系來說，p53 綁定在生存素啟動子上，抑制了生存素的轉錄，ATO 激活了p53，促進了細胞凋亡。對轉染p53 siRNA的抑制，可以阻止由ATO 導致的生存素的下調。

部分文獻指出，在一些細胞系中ATO 誘發的細胞周期的停滯與p53 的增加有關，但也有文獻證實，暴露于ATO 后一些細胞系中p53 蛋白逐漸消失，并且和G1或G2/M 期的細胞周期停滯同時發生。在哪個細胞周期發生停滯與p53 的狀態有關，表達野生型p53的細胞發生G1期停滯，表達突變型p53 在G2/M 期停滯[15]。對于ATO 的反應，表達突變型p53 的細胞似乎比野生型細胞更敏感。p53 似乎對于ATO 誘發的DNA 損傷具有保護作用。有文獻[14]指出，TM4 細胞經過ATO 處理后p53 蛋白逐漸下降，p53 的下調可能和人類雙微體（human double microbody，HDM2）有關，HDM2 可能引起p53 的無用性下調。

3.4 ATO 激活Caspase 依賴的細胞凋亡

Caspase 家族共有11 種，包括Caspase 1-10 以及14，分為凋亡相關性和炎癥相關性Caspase 蛋白，凋亡相關性Caspase 再分為起始相關性（2，8，9，10）和效應相關性Caspase 兩類（3，6，7）。Caspase 最終的效應蛋白為Caspase 3，有活性的Caspase 3 是從30 kD的酶原上的17 和12 kD 的亞基組成的同源二聚體獲得，它的作用是主要有裂解多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]，終 止DNA 修復；活化核酸內切酶，特異性切割核小體之間的連接序列，DNA 斷裂成180～210 bp 大小的片段；破壞細胞骨架蛋白，細胞外基質蛋白、核蛋白等，使細胞失去正常的形態[3]。其他研究也證實了Caspase 3 在化療藥物誘發凋亡中的作用，苯丙烯酸通過激活Caspase 3 及DNA 損傷導致凋亡[15-16]，黃芪通過DNA 斷裂、凋亡調節劑Caspase 3 蛋白表達誘發凋亡[17]。Kumar 等[5]研究表明，ATO 以一種濃度和時間依賴的方式激活Caspase 3。不僅在腫瘤細胞，在正常的豚鼠心肌纖維細胞中也發現，當ATO 濃度達到2～10 μmol/L 時，會出現TGF-1 和p-ERK 蛋白的表達Bax/Bcl-2 的比例增加，以及Caspase 3 的活化[18]。

3.5 ATO 提高細胞內鈣離子濃度

鈣離子濃度的體內平衡是維持正常細胞功能的重要機制。鈣離子可能在調節細胞凋亡的過程中發揮中心作用。ATO 誘發的細胞凋亡和細胞內鈣離子濃度的增加有關。具體機制尚未清楚，現在認為砷劑可以阻止某些酶的活性，誘導DNA 斷裂、影響一些基因如Bcl-2、c-myc 和p53 的表達，這些因子和鈣離子一起在細胞的凋亡過程中發揮重要的作用。鈣離子濃度增高后，各種鈣離子依賴的降解酶如磷脂酶、Caspase 以及內切酶，活性被激活。ATO 誘發的細胞內鈣離子濃度升高的機制為從細胞內鈣儲存庫中釋放鈣。ATO 對細胞內鈣離子濃度的影響程度與基礎的鈣濃度有關，即基礎鈣濃度越低，鈣離子增高的越明顯。不同細胞系對于ATO 的反應不同，或許是因為不同細胞系鈣離子基礎濃度不同[19]。Cai 等[20]研究證實，經過ATO 處理骨髓間充質肝細胞后，Caspase 3 的活性被激活，凋亡細胞的數量增加，且ATO 可以誘發細胞內鈣離子濃度增加，使用細胞內鈣離子螯合劑四乙酸后能明顯減輕ATO 導致的細胞內鈣離子濃度增加。故認為ATO 導致的細胞凋亡除與Caspase 3 的激活有關外，也和細胞內鈣離子濃度的增加有關。

3.6 ATO 活化或開放線粒體PTP

在被誘導產生特征性形態學改變和DNA 降解前，凋亡細胞一個基本的變化是線粒體膜功能的改變即線粒體的通透性改變。主要通過位于線粒體內、外膜之間的一組蛋白復合體，即線粒體通透性轉運孔（permeability transition pore，PTP）來調節其通透性。PTP 復合體由位于線粒體外膜的電壓依賴性陰離子通道、位于線粒體內膜的腺嘌呤核苷酸轉運蛋白以及親環素組成[21]，正常情況下，PTP 處于低電壓狀態；凋亡過程中，三磷酸肌醇介導內質網鈣釋放，致使線粒體鈣超載，PTP 轉為高電壓狀態并開放，這種轉換是不可逆的，且與鈣和PTP 結合位點的飽和度密切相關，陰離子通道的開放，造成水和離子在胞質與線粒體基質間自由擴散，線粒體膜電位瓦解，氧化磷酸化解偶聯，線粒體腫脹，最終導致線粒體外膜破裂，膜間隙內物質釋放。ATO 與腺嘌呤核苷酸轉位蛋白結合，形成二硫鍵，導致線粒體通透性轉運孔開放，線粒體跨膜電位下降或消失，呼吸鏈偶聯及谷胱甘肽耗竭，ROS 產生及細胞色素C、細胞凋亡誘導因子的釋放。

3.7 ATO 對凋亡抑制蛋白的影響

凋亡抑制蛋白家族是細胞自身調節的重要因子，參與炎癥反應、細胞凋亡、細胞分化、細胞增殖、細胞分裂等多種生物過程。在人類的8 種IAPs 中，XIAP、cIAP1、cIAP2，Survivin 和ML-IAP 主要參與細胞內各種信號網絡傳導，包括腫瘤壞死因子超家族、轉化生長因子、分裂原活化Caspase 及氨基末端激酶。IAPs以存在1-3 個保守的IAP 重復序列（baculoviral IAP repeat，Bir），除了Bir 結構域外，還有一些IAPs 具有碳末端環形結構域[22]。

過量表達的IAPs 可以使腫瘤細胞對化療產生耐藥性，同時也抑制了化療或放療引起的凋亡。線粒體smac/Diablo 蛋白對于凋亡具有抑制作用[3]。在凋亡抑制蛋白家族中研究較多的是Survivin 蛋白。Survivin結構較為獨特，含有一個N 末端的桿狀凋亡抑制蛋白重復序列，羧基末端無環指結構，而是α-螺旋，其基因定位于染色體17q25，有3 個內含子和4 個外顯子，編碼142 個氨基酸蛋白，約16.5 kD，Survivin 具有腫瘤特異性。高表達于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細胞的分化增殖、浸潤及轉移密切相關。生存素mRNA陽性患者5年生存率明顯低于生存素mRNA 陰性的患者[23]。Li 等[24]研究表明，兔子肝臟種植上VX-2 腫瘤后，經過ATO 干預后，腫瘤組織上的Survivin 的表達水平較對照組明顯降低，從而證明Survivin 可能在ATO 誘導細胞凋亡的過程中發揮一定作用。

3.8 ATO 抑制端粒酶活性及端粒酶逆轉錄基因的表達

有證據表明，ATO 可能通過抑制端粒酶的活性及縮短端粒酶的長度來達到抑制腫瘤生長的目的，這種作用具有濃度和時間依賴性[25]。Zhou 等[26]研究發現，經過ATO 處理后端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）mRNA 的表達與端粒酶的活性成比例下降，表明ATO 對端粒酶活性的作用受hTERT 轉錄基因的調控，另外，逆轉錄酶和hTERT mRNA 和凋亡程度存在正相關。目前已確定端粒酶活性的抑制是凋亡程序的早期事件[27]。向宮頸癌細胞轉染野生型hTERT 后，大大降低了脫乙酰化酶抑制劑誘導的細胞凋亡，因此，ATO 對于端粒酶的抑制可以認為是走向凋亡的重要事件。

3.9 ATO 抑制NF-κB 活性

Rel-NF-κB 蛋白家族由五種單體組成同源二聚體或異源二聚體。當細胞未受到刺激時，NF-κB 通過與其特異性抑制劑IκB 相互作用，以一種非活性狀態存在于細胞質中。一旦經過多重信號通路激活，IκBs將發生磷酸化并迅速降解，游離的NF-κB 二聚體跨過核膜進入細胞核內，結合到κB 結合位點的引物區域，誘導靶基因的轉錄。ATO 對于NF-κB 的作用目前存在爭議。Amrán 等[28]在幼稚單核細胞白血病細胞系中發現ATO 并不能增加NF-κB 的轉錄活性，并得出結論：ATO 誘導的單核細胞白血病細胞系的凋亡不依賴于NF-κB 的結合活性，而與死亡受體途徑及線粒體途徑相關。Xu 等[29]研究表明，在MUTZ-1 和SKM-1細胞系中，ATO 誘導凋亡通過兩種獨立的途徑：①激活Caspase 3、8 及DNA 聚合酶；②抑制NF-κB 的活性，繼而下調端粒酶轉錄酶的表達。Ma 等[30]對肝癌細胞系進行研究表明，ATO 抑制了NF-κB 的活性，繼而調節了cyclin D1、Bcl-xL、Bcl-2 等凋亡相關基因的表達，最終導致了細胞的凋亡。

綜上所述，ATO 誘導的腫瘤細胞凋亡為非單一機制，從刺激活性氧的產生、抑制p53、調節Bcl-2 家族、升高細胞內鈣離子濃度、降低線粒體跨膜電位到激活Caspase 家族，以及對凋亡抑制蛋白、NF-κB 的調控，參與到線粒體途徑誘發細胞凋亡的各個環節中，對其機制的研究，為選擇ATO 增敏劑提供了更廣泛的思路，可為ATO 耐藥患者的臨床治療尋找更多的方法。如現在人們已經發現維生素C 或L-丁硫氨酸-SR-磺基（BSO）可以降低細胞內還原型谷胱甘肽濃度，其為活性氧主要消除物質，這樣間接地增加了細胞內活性氧濃度，使得腫瘤細胞對于ATO 更加敏感[31]。

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