酶聯免疫檢測抗-HCV方法的探討與試劑的評價

王英莉

酶聯免疫檢測抗-HCV方法的探討與試劑的評價

王英莉

丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒(HCV)感染導致的肝臟發生炎癥壞死和纖維化的嚴重傳染病。HCV的主要傳染源有急性和慢性丙型肝炎患者及HCV無癥狀攜帶者。主要通過輸血及血制品傳播。血液傳播是以前最主要的丙肝傳播途徑,不過隨著獻血者的篩查,此傳播方式已得到明顯控制,但是由于目前檢查手段的原因,輸血仍有傳播丙型肝炎的可能,特別是反復輸血、血制品者。為控制輸血傳播HCV,必須用敏感準確的方法對獻血員獻出的血液進行HCV抗體檢測。第三代診斷試劑是目前使用的抗-HCV檢測試劑最多的,多采用酶聯免疫間接法來檢測血清中HCV IgG抗體。由于IgG抗體出現的時間較晚,早期感染者采集的標本很容易被漏檢；另外,還存在一定的假陽性結果,是血清中類風濕因子以及非特異性IgG的吸附等干擾造成的。

丙型肝炎病毒；丙肝抗體；酶聯免疫法；雙抗原夾心法；窗口期；特異性

雙抗原夾心法診斷試劑借助生物素-親和素級聯放大,檢測IgM、IgG等總抗體,縮短了窗口期,同時提高了試劑靈敏度。

試驗原理：夾心酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法是微孔板內預包被基因工程重組表達的HCV抗原,第一步加入生物素化HCV抗原和血清或血漿樣本,樣本中的HCV抗體能與包被抗原及生物素化HCV抗原相結合,形成“包被抗原-抗體-生物素化抗原”復合物；第二步加入酶標試劑,溫育并洗滌后加入TMB底物顯色。若樣品為HCV抗體陽性,HRP催化底物顯色,若樣本為陰性,則不顯色。加入終止液后,通過酶標儀測定吸光值(A值),從而判斷樣本中丙型肝炎病毒HCV)抗體的存在與否。間接ELISA法是微孔板內預包被基因工程重組表達的HCV抗原與血清或血漿中抗HCV抗體反應,再加入HRP標記抗人IgG的酶標記抗體與之結合,然后用TMB系統作用顯色。

目前萬泰生物藥業股份有限公司生產的雙抗原夾心法診斷試劑的敏感性和特異性均優于間接法,本實驗室對雙抗原夾心法與間接法進行了性能檢測,分別采用三種試劑對7632份血漿樣本同時進行檢測,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 血漿樣本 遼陽市中心血站2013年5月20日～11月20日獻血員血漿樣本共7632份。

1.2 試劑 抗-HCV間接法檢測試劑：廈門英科新創股份有限公司生產的丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒,批號2012085822；抗-HCV雙抗原夾心法檢測試劑：北京萬泰生物藥業股份有限公司生產的丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒,批號CS20130301；確認試劑：丙型肝炎病毒抗體確證試劑盒(重組免疫印跡法) 批號：RC20131001。

1.3 方法 對于7632份樣本采用雙抗原夾心法與間接法同時檢測抗-HCV。采用Chiron,RIBA對上述任一試劑檢測為陽性或可疑的樣本進行檢測。

2 結果

7632份檢測樣本中,7597份為陰性,26份均為陽性,1份間接法檢測為陰性雙抗原夾心法檢測為陽性,6份間接法檢測為陽性雙抗原夾心法檢測為陰性,2份雙抗原夾心法陰性而間接法檢測OD值為接近臨界值的可疑樣本。

間接法和雙抗原夾心法檢測均為陽性的26份樣本中,RIBA確證實驗結果21例為陽性,1例為陰性,4 例為可疑；間接法檢測為陽性雙抗原夾心法檢測為陰性的6例樣本4例確證為陰性,2例確證為可疑,間接法檢測為陰性雙抗原夾心法檢測為陽性的1例樣本確證為陽性。

目前公認的檢測丙肝抗體的準確方法為RIBA,以此為標準,本實驗室間接法和雙抗原夾心法的特異性分別統計為99.65％(7605 /7632)和99.55％(7598 /7632)。

實驗結果證實了雙抗原夾心法與RIBA的符合率為96.3％ ,間接法與RIBA的符合率為76.5％,抗-HCV雙抗原夾心法的特異性比間接法提高了一個百分點,所產生的灰區和假陽性樣本大幅度減少。

另外,間接法只檢測IgG,雙抗原夾心法增加了IgM的檢測,因此窗口期縮短,提高了獻血員抗-HCV的檢出率；同時檢測時加樣量從間接法的10 μl提高到50 μl,大大減少了全自動加樣系統的漏加率,消除了一定的安全隱患。

3 討論

雙抗原夾心法與間接法相比較有如下特點：①夾心法間接法檢測IgM、IgG等總抗體檢測IgG抗體窗口期縮短；②形成包被抗原-抗體-生物素化抗原復合物形成包被抗原-抗體-抗人IgG抗體復合物特異性增強；③借助生物素-親和素級聯放大原理無生物素-親和素級聯放大效應靈敏度提高；④方法學革新,加樣量增加(50 μl),減少試驗誤差方法學限制,加樣量有限(10 μl)；⑤抗-HCV ELISA檢測方法在不斷完善,應用雙抗原夾心法檢測抗-HCV,實用性強,可降低非特異性反應,提高檢測準確率,縮短窗口期,更好的減少血液浪費,避免輸血傳播疾病。

綜上所述,為了防止漏檢,《獻血者健康檢查要求》(GB 18467-2011) 明確要求血液篩查必須用兩種不同廠家試劑進行檢測,因此要定期進行試劑的質量評價,正確選擇檢測試劑,既要增加靈敏度,又要有較高特異性,避免漏檢的風險,減少血液資源的浪費,更好地為臨床提供安全合格血液為患者服務[1]。

[1]何敏,朱葉,馬洋,等. 抗-HCV雙抗原夾心法酶聯免疫檢測試劑的應用評價.吉林醫藥學院學報,2012,66(4):244-245 .

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.03.180

2014-11-14]

111000 遼陽市中心血站