帕金森病的生物標志物研究進展

張樹山，朱 陶綜述，余巨明審校

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種常見的中樞神經系統變性疾病，以靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態異常等運動癥狀為主要表現，常伴睡眠障礙、自主神經功能紊亂和神經精神障礙等非運動癥狀。盡管我們在PD 發病機制研究中取得了長足進步，但PD 的診斷主要還是依靠臨床癥狀。最近的研究顯示在PD 初期的誤診比例較高，即使在專科門診這種情況亦不少見。PD 患者一般僅在多巴胺能神經元減少50%和/或多巴胺水平降低達70%～80%的情況下才表現出典型的運動癥狀，但此時患者已錯過治療的最佳時機。先前的臨床、病理及影像證據均顯示神經變性在出現典型運動癥狀前的許多年就已經開始了，新近的研究主要致力于尋找臨床前期或至少是運動前期的生物學標志物，此時，多巴胺能神經元相對存活較多，且神經保護治療可能有效。本文擬將PD 生物學標志物相關研究進展綜述如下。

1 臨床癥狀

據Braak 病理分期，PD 患者一般在Braak 病理分期達3～4 期時才出現典型的運動癥狀，但在出現運動癥狀之前可出現多種非運動癥狀，為早期診斷PD 提供了重要線索。非運動癥狀主要包括嗅覺障礙、睡眠障礙、自主神經功能紊亂、情感障礙和認知損害等。

1.1 嗅覺障礙 1975 年Ansari 和Johnson 提出嗅覺障礙可能與PD 有關［1］，后Ross 發現嗅覺障礙可以早于PD 臨床癥狀至少4 y［2］。由于嗅覺檢測方法簡便，它有可能成為一種篩查PD 高危人群的理想指標，但嗅覺障礙亦常見于其他中樞神經系統變性疾病，所以，嗅覺檢測不能單獨成為一個理想的生物學標志物。

1.2 便秘 許多臨床研究發現早期PD 患者伴有自主神經功能紊亂，便秘則是比較突出的自主神經功能紊亂。相關臨床研究顯示，腸蠕動與PD 關系密切，長期便秘可能增加PD 的發病風險;且自主神經功能紊亂可在PD 運動癥狀出現前即已發生。2012 年進行的一項針對普通人群的大型隊列研究結果證實便秘與PD 的發病風險有關［3］。但由于評價方法和特異性等問題，便秘也不能成為一個理想的生物學標志物。

1.3 快速眼動睡眠期行為障礙 RBD(rapid eye movement sleep behavior disorder，RBD)是PD 最常見的非運動癥狀之一。約有20%的PD 患者RBD 先于運動癥狀出現，28%～45%的RBD 患者于發病后5 y 出現運動癥狀，發病后10 y出現運動癥狀的比例高達40%～65%［4］。神經影像學研究發現:合并RBD 的患者紋狀體多巴胺轉運蛋白(dopamine transporter，DAT)攝取率呈進行性下降，提示RBD 可能是PD的臨床前生物學標志物。由于在臨床實際工作中RBD 患者就診率低且診斷程序繁雜，且缺乏特異性，將RBD 作為早期診斷PD 的生物學標志物尚存在一定困難。

1.4 抑郁癥 抑郁癥以情感低落、思維遲緩及意識活動減退為主要表現，在PD 典型運動癥狀出現之前即可存在。大約20%～40%PD 患者合并抑郁癥，提示抑郁癥可能成為診斷PD 的生物學標志物。但目前抑郁癥與PD 運動癥狀之間的關系尚不十分清楚。

2 α-突觸共核蛋白(α-synuclein)

目前，關于PD 早期診斷的生物化學標志物研究涉及免疫學、炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡等多個領域，其中以αsynuclein 最具研究前景。α-synuclein 是由140 個氨基酸組成的中樞神經系統突觸前表達的可溶性蛋白，生理條件下，其在調節突觸的可塑性和神經分化方面起重要作用，另外它是路易小體的主要成分。SNCA 基因突變可導致家族性PD 顯示了α-synuclein 在PD 發病機制中的作用。α-synuclein 的集聚誘發蛋白質錯誤折疊，且傾向于集聚成有毒的低聚化合物，從而啟動PD 的神經變性過程。因此若在腦脊液、血漿或唾液等體液標本中檢測到α-synuclein，則可為診斷PD 提供重要線索。然而，翻譯后修飾產生的特異α-synuclein 缺失阻礙了我們對細胞外α-synuclein 水平的直接檢測。Gorostidi A等對血漿α-synuclein 單體的檢測得出不確定且具爭議的結論，而最近的研究顯示與正常對照組比較，檢測PD 患者血漿中升高的 α-synuclein 寡聚體水平具較高的特異性(85%)［5］。90%的磷酸化α-synuclein(Ser129)沉積在路易小體中，而正常腦組織中只有4%的α-synuclein 處于磷酸化狀態，故磷酸化α-synuclein 在PD 發病機制中發揮重要作用。實際上，研究證實PD 患者血漿中磷酸化α-synuclein 水平高于正常對照組，而外周血單核細胞中的α-synuclein 單體水平在PD 組和對照組無明顯差異，進一步的研究發現PD 組硝基化的α-synuclein 水平明顯高于對照組［6，7］。

PD 的病理變化不僅僅局限在中樞神經系統，中樞病理變化與外周免疫系統相互作用已被充分研究，是否存在其它的可以影響中樞神經系統的外周機制仍有一定爭議。考慮到腦脊液毗鄰產生病理變化的區域，且可以反映各種條件下腦代謝的情況，許多科學家致力于研究腦脊液，希望得到可靠的PD 生物學標志物。腦脊液中α-synuclein 的檢測方法剛剛建立起來，許多的變量(如腦脊液收集時間、血液污染和儲藏條件等)均可顯著影響結果，為了使各個研究的結果據可比性，建立一套標準檢測程序就顯得非常重要。即使在這種情況下，大多數的研究仍顯示共核蛋白病腦脊液總的α-synuclein 水平降低［8］。但腦脊液中α-synuclein 水平下降原因不明，可能是多種機制共同作用的結果，例如寡聚體的沉積、多巴胺能神經元減少所致的蛋白分泌功能受損、蛋白翻譯或加工異常。Tokuda 等研究顯示PD 患者組腦脊液α-synuclein寡聚體及寡聚體/總量比值均明顯高于正常對照組，其診斷靈敏度達90.60%、特異度達89.30%［9］。提示腦脊液α-synuclein 寡聚體及寡聚體/總量比值有可能成為早期診斷PD的理想標志物。

檢測腦脊液和外周血中α-synuclein 水平存在諸多問題，如取材不便、樣本易污染等。因此Devic 等首次利用唾液腺進α-synuclein 檢測［10］，結果顯示與正常對照組相比，PD 組患者唾液腺中α-synuclein 水平降低。提示唾液腺亦有可能成為新的樣本來源，為PD 生物學標志物研究開辟了新的途徑。

3 DJ-1

DJ-1 是參與和神經變性相關的轉錄調控、氧化應激反應的同源二聚體蛋白。DJ-1 基因(PINK7)突變導致罕見的常染色體隱性遺傳性PD。先前有研究顯示血漿DJ-1 水平在PD 組和正常對照組無明顯差異，直接測定全血中DJ-1 對PD的診斷沒有幫助。最近一項研究通過測定全血中經翻譯后修飾的DJ-1 水平發現:經4-羥基壬烯醛誘導的DJ-1 亞型水平在PD 組明顯高于阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者組和正常對照組［11］，后續的研究發現PD 患者腦脊液中DJ-1 水平升高，甚至在疾病的早期這種情況就已經存在［12］。針對上述情況，研究人員聯合腦脊液中DJ-1 和α-synuclein、總tau 蛋白、磷酸化tau 蛋白、β 淀粉樣肽1-42、Flt3 配體和不規則趨化因子等多種指標，對特定類型的PD 患者研究發現:多指標聯合應用在PD 與其它變性疾病的鑒別診斷中特異性及敏感性均較高，且和疾病的進展和嚴重程度存在相關關系［13］。在大多數的醫院，腦脊液都不容易獲得，且腦脊液蛋白測定易受血液污染影響，所以目前有研究試圖尋找其他組織來源的生物標志物。最近，人們在唾液腺中發現了DJ-1，而唾液腺不易被血液污染，使其可能成為一個潛在的可實際應用的生物標志物。

4 氧化應激生物學標志物

氧化應激在PD 的發病機制中居核心地位，貫穿了神經變性發生發展整個過程。先前的研究顯示PD 患者在外周血單核細胞中產生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)較正常人多。每日服用左旋多巴劑量與自由基水平呈負相關關系，提示外周血淋巴細胞氧化應激水平增高是可能的致病機制，左旋多巴治療可能存在神經保護作用;后續的研究證實在未服藥的PD 患者外周血單核細胞總的活性氧和線粒體活性氧水平增加［14］;進一步證實了先前的研究結論:PD 存在線粒體功能缺陷，這種缺陷包括呼吸鏈復合物缺陷、細胞凋亡信號誘導的和氧化應激導致的單核細胞DNA 損傷。然而，外周血活性氧水平特異性較低，并不是一個令人滿意的生物學標志物。此外，很多情況如正常老化、吸煙、運動、食物、藥物等都會影響機體氧化應激水平，在實際操作中很難控制這些混雜因素。顱內清除氧自由基最重要的物質是谷胱甘肽，其生物活性依靠兩個關鍵酶:谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)和谷胱甘肽巰基轉移酶(glutathione S transferase，GST)，它們負責催化谷胱甘肽由還原型轉變為氧化型。研究發現不僅基底節區而且外周血細胞中氧化型GPX 和GST 含量均增高，提示這些抗氧化劑可能是可靠的PD 生物學標志物。

尿酸廣泛存在于包括腦脊液在內的各種細胞外液，是一種較強的抗氧化劑。研究顯示高尿酸與PD 風險呈負相關，腦脊液中含較高尿酸的患者預后較好，臨床進展更慢［15］。在PD 的研究中，尿酸曾被認為是一個很有希望的神經保護劑，但后續的研究結果不一致，限制了其臨床應用。

5 高香草酸(homovanillic acid，HVA)

HVA 是多巴胺最重要的代謝產物。最初的研究顯示PD患者腦脊液中HVA 較正常對照降低。然而，很多偏倚可以影響數據的準確性，比如HVA 由紋狀體進入腦脊液通道受限，容易被持續分泌的腦脊液稀釋。實際上，DATATOP 研究顯示各個研究腦脊液中HVA 差異很大，所以HVA 不是一個理想的生物學標志物［16］。考慮到顱內多巴胺代謝和嘌呤代謝相互影響大，一些研究通過同時測定腦脊液中的高香草酸和黃嘌呤發現:應用高香草酸/黃嘌呤比值鑒別PD 和正常對照相對容易，且和疾病進展存在相關關系，提示其可能成為一個理想的生物學標志物［17］。

6 蛋白組學、代謝組學、轉錄組學

近年來質樸技術(蛋白組學、代謝組學、轉錄組學)的應用，使我們無需借助特異性抗體也可以檢測諸如腦組織、血漿、尿液或腦脊液的蛋白圖譜或代謝圖譜的細微變化。蛋白組學是對特定時刻的生物樣本中所有蛋白的定性和定量分析，提供了大量的可以用來比較不同疾病狀態的數據，是一種沒有偏倚的方法。

通過檢測外周血細胞的蛋白圖譜，研究人員期望從外周血單核細胞系統分離的蛋白組(包括肌動蛋白解聚因子-1、原肌球蛋白、γ-纖維蛋白原、ATP 酶β 亞基和一個基本的肌動蛋白變體)可以用于PD 的診斷。另一項蛋白組學研究顯示表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)是一個很有希望的提示PD 認知功能減退的生物學標志物，據Chen-Plotkin報道，EGF 水平越低，PD 患者的認知功能損害越明顯，且經過長時間的隨訪，進一步的亞組分析顯示EGF 水平較低的患者更易進展為癡呆［18］。

盡管血液污染可使腦脊液的蛋白圖譜發生巨變，腦脊液依然很適合用來做蛋白組學研究。最近一項蛋白組學研究也顯示:另一個腦脊液蛋白組(包括腦源性神經生長因子、載脂蛋白AII、載脂蛋白E、白介素-8、A-β 42、β2-微球蛋白、維生素D 結合蛋白)作為帕金森診斷的生物學標志物優勢明顯［19］。

在神經變性疾病發病發展過程中，由基因、外源性物質、蛋白質調節的新陳代謝圖譜有可能受到影響，且每一種疾病可能都具有獨特的代謝圖譜。代謝組學研究生物樣品中代謝途徑的小分子終產物，并通過多變量數據分析以避免混雜因素。這種方法已經成功應用于尋找多種疾病的可能生物學標志物，例如心肌梗死、精神分裂癥和2 型糖尿病。最近，通過代謝組學方法研究外周血樣品，研究人員得到了PD 患者和正常人的完全不同的代謝圖譜，并發現PD 患者尿酸水平顯著下降，而8-羥基脫氧鳥苷、丙酮酸水平明顯增加［20］。

轉錄組是細胞所有轉錄產物的集合，包括信使RNA(mRNA)、核糖體RNA(rRNA)、轉運RNA(tRNA)和其它非編碼的信使RNA，反應在某一特定時刻處于激活狀態的基因表達情況。轉錄組學采用以DNA 微陣列技術為基礎的高通量技術研究特定細胞族群的mRNA 水平。不幸的是，mRNA水平輕微變化就可以導致其編碼蛋白總量的巨大差異，所以對mRNA 相對表達水平的判讀就顯得異常復雜。轉錄組學通過研究PD 患者、正常對照和動物模型的基底節區細胞的表達圖譜發現不同基因的表達圖譜結果不完全一致，但都存在氧化應激、線粒體功能、多巴胺轉運相關基因的激活［21］。

通過對血液標本的轉錄組學研究發現ST13 基因表達水平較低，此基因編碼熱休克蛋白-70 的輔助因子，其在α-synuclein 錯誤折疊過程中發揮重要作用［22］，但后續的研究未能進一步證實其功能。這些候選的生物學標志物都需要基于抗原抗體的綜合方法(如Western blot 或ELISA)進一步驗證。而且，各種組學方法需要大量的專業技術知識，限制了其在實際工作中大范圍應用。但蛋白組學圖譜、代謝組學圖譜和轉錄組學圖譜作為新的PD 生物學標志物臨床應用前景依然廣闊，是未來的發展方向。

7 影像學標志物

7.1 經顱超聲 經顱超聲是診斷PD 敏感性和特異性較高的檢測工具。約90%的PD 患者于疾病早期即可檢測到黑質高回聲，且經顱超聲具有無創、無輻射、對患者依從性要求低等優點，但對操作者技術水準要求高和缺乏特異性限制了其臨床應用［23］。

7.2 擴散張量成像(diffusion tensor imaging，DTI)普通的MRI 序列不能很好的顯示黑質結構，DTI 可以通過測量組織內擴散的部分各向異性(fractional anisotropy，FA)而提高MRI 對黑質結構變化的敏感性。最近通過影像技術研究發現PD 患者黑質尾部FA 值均明顯低于正常對照組，提示通過觀察黑質尾部FA 值的變化可能有助PD 的早期診斷［24］。

7.3 PET 和SPECT PET 和SPECT 是研究PD 黑質-紋狀體多巴胺能神經元生化變化和示蹤劑代謝變化的重要功能影像學方法，包括突觸前和突觸后功能成像。聯合PET 和SPECT 檢測紋狀體示蹤劑攝取程度研究顯示PD 患者組示蹤劑年攝取量下降率為4%～13%，而正常對照組僅為0%～2.50%［25］。但神經影像診斷技術特異性較低，尚不能很好地鑒別PD 與其他疾病引起的帕金森綜合征，如多系統萎縮(multiple system atrophy，MSA)和進行性核上性眼肌麻痹(progressive supranuclear palsy，PSP)等。

8 小 結

目前PD 尚缺乏有效的神經保護治療，比較樂觀的觀點認為在隨后的若干年里我們會在這方面取得長足進步。所以，臨床上迫切需要敏感性和特異性較高的可靠的生物學標志物用于PD 的診斷，特別是用來診斷臨床前期的患者，針對這部分患者早期啟動神經保護治療可能延緩疾病的進展。除了需要早期診斷疾病的標志物，我們也亟需可以反映疾病進展情況的可靠標志物，用以客觀評估疾病嚴重程度和對癥治療或神經保護治療的功效。未來研究的目標是在容易獲取組織如外周血或唾液腺中尋找神經變性的可靠生物學標志物。但是，單一生物學標志物的診斷價值十分有限，且存在一定的局限性，因而，在PD 的診斷、鑒別診斷、疾病進展及嚴重程度等方面，未來的發展趨勢是多種生物學標志物聯合應用。

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