蛋白激酶CK2α與食管癌發生發展及臨床病理因素的相關性研究

羅鳴 明幫春 駱志國 明星

食管癌在我國的發病率一直居高不下，其中常見類型為鱗癌。食管癌患者早期無明顯不適，不易引起重視，多數患者在出現進行性吞咽困難時才到醫院就診，此時疾病多已進展到中晚期，癌癥多發生遠處轉移。食管癌的發生、進展與多種基因表達異常有關，如CD47、miR-21、HER2等基因的高表達和 miR-133a、PTEN等基因的低表達，但這些基因仍不能完全闡釋食管癌的復雜［1］。因此，分子標志物的探討一直是臨床診斷食管癌的重點。研究已證實，蛋白激酶CK2α在多種癌癥中表達量高，在癌癥發展過程中發揮重要作用［2］。本文研究蛋白激酶CK2α對食管癌診斷的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取本院收治的120例食管癌患者作為研究對象，其中男65例，女55例;年齡41～77歲，平均年齡(58±11)歲;臨床T分期:T1期0例、T2期5例、T3期26例、T4期89例;未發現淋巴結轉移102例、轉移18例;TNM分期:Ⅰ期11例、Ⅱ期51例、Ⅲ期58例。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準:所有患者均經胃鏡活檢、病理證實為食管鱗癌;既往無腫瘤疾病史;初治患者;患者均按照UICC分期(1997)進行臨床分期，分期中M1a是指胸上段食管癌頸淋巴結轉移，胸下段食管癌腹腔淋巴結轉移。

1.2.2 排除標準:既往其他腫瘤病史者，近期使用化療或放療等抗腫瘤治療方式的患者，未進行病例確診的患者。

1.3 儀器與試劑 陜西超英生物有限公司提供的組織芯片，編號為ESI202。該組織芯片可采集120點，包括食管癌和距腫瘤1.5 cm以內的癌周組織。英國Abcam公司生產的CK2α單克隆抗體。美國Invitrogen公司生產的PCR試劑盒。江蘇碧云天公司提供組織蛋白抽提試劑盒;武漢谷歌公司提供WB制膠試劑盒;武漢博士德公司提供CK2α兔鼠二抗;ECL western印染發光試劑盒購自美國Thermo公司;OligodT與引物購自上海Invitrogen公司。

1.4 標本采集 手術切除腫瘤組織、癌周組織和距離病灶5 cm及以上且沒有腫瘤細胞浸潤的組織，共9對，送檢病理室。

1.5 實驗方法 (1)免疫組化檢測食管癌組織內CK2α抗體表達:制備石蠟切片，使用二甲苯對組織切片脫蠟，且運用不同濃度乙醇脫水，在96℃下經10%的檸檬酸(碧云天，中國)修復抗原。使用羊血清封閉非特異性抗原。CK2α抗體在4℃中孵育12 h，沖洗后加入酶標兔鼠二抗，室溫孵育1 h，染色。(2)Westernblot檢測食管癌組織內CK2α表達:切下約20 μg的癌癥組織與相對應的正常組織，根據蛋白抽提試劑盒說明書提取組織蛋白。通過BCA試劑盒定量所提取的蛋白，使用酶標儀檢測蛋白純度與濃度，調節每份樣品的蛋白濃度，在－80℃下保存蛋白。采用WB制膠試劑盒(谷歌，中國)制作SDS聚丙烯酰胺凝膠，上樣緩沖液中加入等量的蛋白，煮沸，變性蛋白。電泳、轉膜，再運用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜非特異性抗原位點，加入CK2α抗體4℃過夜，PBST洗膜，ECL試劑顯色后，最終使用X線膠片顯影，計算機下分析膠片灰度值。實驗重復3次。(3)mRNA檢測:分離50 μg的食管癌組織與癌周組織，使用Trizol方法提取RNA，紫外分光光度計260/280鑒定樣品的濃度與質量，電泳證實總RNA完整性。取5 μg總RNA，根據美國Invitrogen公司PCR試劑盒說明書進行操作，采用PCR法測量mRNA。CK2α基因的引物設計序列如下:正義鏈序列為:5’-CGAGTTGCTTCCCGATAC-3’，反義鏈序列為:5’-CTCAGGGCTGACAAGGTG-3’。

1.6 免疫組化結果的評價標準 免疫組織化學法的結果判定標準，按照著色強度進行分級，0分:無色;淡黃色:1分;棕黃色:2分，褐色:3分;顯微鏡下染色陽性細胞計數:1% ～25%:1分;26% ～50%:2分;51%～75%:3分;＞75%:4分;兩個得分項目相加為最終評分，(－)為總分＜3分，陰性表達;(+)為3分，弱陽性表達;(++)為4分，中陽性表達;(+++)為5分，強陽性表達。

1.7 統計學分析 應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以±s表示，2組間計量資料采用2組獨立樣本t檢驗，計數資料采用χ2檢驗、等級資料采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化染色結果中食管癌組織與癌旁組織中的CK2α陽性細胞表達情況 食管癌組織中的CK2α中陽性與強陽性表達率分別為35.83%、55.83%均高于癌旁組織的11.67%和0。兩種不同組織類型的CK2α表達差異有統計學意義(P＜0.05)。圖1A為食管癌組織中CK2α的中陽性表達，圖1B為食管癌組織中的 CK2α強陽性表達，圖1C為食管癌組織中CK2α的弱陽性表達，圖1D為癌旁組織的CK2α陰性表達。見表1、圖1。

表1 2組CK2α表達陽性率比較 n=120，例(%)

圖1 食管癌組織CK2α著色情況(免疫組化×40)

2.2 CK2α在食管癌組織中的表達與臨床分期及淋巴結轉移的關系 CK2α陽性表達情況與在不同T分期、淋巴結轉移間差異無統計學意義(P ＞0.05)，CK2α陽性表達分布在不同臨床TNM分期間差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表2。

表2 CK2α在食管癌組織中的表達與臨床分期及淋巴結轉移的關系例

2.3 CK2α蛋白與CK2αmRNA在食管癌組織與癌旁組織中的表達差異 食管癌組織中的CK2α蛋白、CK2αmRNA表達均高于癌旁組織(P ＜0.05)。見表3、圖2。

表3 CK2α蛋白與CK2αmRNA在食管癌組織與癌旁組織中的表達差異n=19，±s

表3 CK2α蛋白與CK2αmRNA在食管癌組織與癌旁組織中的表達差異n=19，±s

組織類型 CK2α蛋白(灰度值) CK2αmRNA(RQ值)5.1 ±1.8 3.2 ±0.8癌旁組織 2.7 ±1.1 1.2 ±0.5 t值食管癌組織5.044 8.856 P值 ＜0.001 ＜0.001

圖2 CK2α蛋白與CK2αmRNA在食管癌組織與癌旁組織中的表達差異

3 討論

我國每年因食管癌的死亡的人群占所有癌癥死亡人的1/4。外科手術是食管癌的主要治療措施，癌細胞浸潤組織的范圍大小不同，其手術切除范圍和術后生存時間的長短差異較大，早期患者5年存活率約70%［3］。食管癌發病初期，癌細胞僅浸潤于黏膜或黏膜下層，此時期患者無明顯不適或者僅感到胸骨后刺痛、進食哽噎感和反酸噯氣等輕微癥狀;當患者因進食困難、呼吸困難、聲音嘶啞、營養不良和體重下降等癥狀就診時，病情已進展到中晚期，該時術后5年生存率為10% ～20%［4］。因此，食管癌的早期診斷具有重要意義。

目前，食管癌的主要診斷方法有CT、MRI等影像技術和病理組織學，其中病理組織學檢查結果是食管癌確診的根本依據。沒有特異的食管癌相關腫瘤標志物可早期診斷食管癌。所有真核細胞中均含有蛋白激酶CK2，它具有多種生物功能，主要由2個催化亞基和2個調節亞基構成。CK2α屬于該蛋白激酶的催化亞基，是主要的功能基團，主要作用是促使蛋白磷酸化，多種蛋白代謝過程中均有磷酸化底物的參與。

腫瘤的生長過程是癌細胞和宿主之間的相互作用的結果，與蛋白激酶CK2α促使蛋白磷酸化的功能有直接關系［5］。蛋白激酶CK2α可作為一種癌基因，可作為癌癥治療的一個可能靶點，它既可促進細胞有絲分裂、增殖，還具有誘導凋亡作用。機體內多種信號通路的轉導都需要蛋白激酶CK2α的參與，且在多種癌組織中高表達，如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、肺癌等［6，7］。研究報道，頭頸部鱗癌組織中蛋白激酶CK2α的含量和活性明顯增多，增加程度與癌癥的侵襲性和預后間存在相關性［8］。蛋白激酶CK2α可能通過促使核受體輔阻遏物的磷酸化，阻止其泛素化而發生代謝分解，最終促進癌細胞的侵襲［9］。食管癌組織中的CK2α中陽性與強陽性表達率明顯高于癌旁組織，提示蛋白激酶CK2α可能參與食管癌的發病。

喉癌細胞的凋亡過程中CK2α起到關鍵性作用，有可能作為該癌癥治療的分子靶點，另外，蛋白激酶CK2α與直腸癌的分期、分化和侵襲有關，可作為判斷直腸癌預后的一個指標。因此，蛋白激酶CK2α可作為一些癌癥的腫瘤標志物和評估患者預后的指標。食管癌患者的預后與其TNM分期有著密切的關系，有研究報道，根據蛋白激酶CK2α的表達量可推測食管癌的進展程度［10］，本研究顯示，食管癌組織中的CK2α蛋白表達和CK2αmRNA均顯著的高于癌旁組織，提示蛋白激酶CK2α可作為食管癌臨床分期的預測指標。

綜上所述，蛋白激酶CK2α與食管癌的發生和癌細胞侵襲存在重要的聯系，可以作為臨床上對食管癌病變程度的一種分子判定標準。本研究的不足之處在于樣本量小，說服力不夠，后續研究應加大樣本，重復進行體內外實驗，進一步證實蛋白激酶CK2α可作為食管癌病程進展的預測指標。

1 王立東，宋昕.環境和遺傳因素交互作用對食管癌發生的影響.鄭州大學學報(醫學版)，2011，46:1-3.

2 赫捷，邵康.中國食管癌流行病學現狀、診療現狀及未來對策.中國癌癥雜志，2011，21:501-503.

3 黃軼軒，周少華，薛洪省，等.蛋白激酶CK2與人類惡性腫瘤.中國肺癌雜志，2012，15:439-441.

4 張薇，張元元，蔡灝，等.蛋白激酶CK2β亞基在肝癌中上調表達及其對肝癌細胞增殖和遷移的影響.復旦學報(自然科學版)，2013，52:247-249.

5 Laramas M，Paramas D，Filhol O，et al.Nuclear localization of protein ki-nase CK2 catalytic subunit(CK2 alpha)is associated with poor prognostic factors in human prostate cancer.Eur J Cancer，2007，43:928-934.

6 劉超，劉洋，趙頌，等.蛋白激酶CK2抑制劑TBB對甲狀腺鱗癌細胞株SW579 CK2β和Akt表達的影響.吉林大學學報(醫學版)，2012，38:276-280.

7 薛劍，靳安民，呂海，等.CK2抑制劑對骨肉瘤細胞增殖和侵襲力的作用研究.中國現代醫學雜志，2013，23:38-40.

8 Ahmad KA，Wang G，Slaton J，et al.Targeting CK2 for cancer therapy.Anticancer Drugs，2005，16:1037-1043.

9 陳勃，董忠誼，曹傳輝，等.蛋白激酶CK2β在食管癌中的表達及其臨床意義.南方醫科大學學報，2012，32:1491-1493.

10 曹傳輝，陳勃，梁基韻，等.蛋白激酶CK2α在食管癌中的表達及意義.廣東醫學，2013，34:1680-1683.