骨肉瘤常用化療藥物作用的分子機(jī)制及用藥方法選擇

徐袁秋 劉思源 張衛(wèi)華 劉星 林亮 許新明

骨肉瘤是最常見的原發(fā)于骨組織的惡性腫瘤，好發(fā)于青少年，易發(fā)生早期肺轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，是嚴(yán)重危害青少年健康的惡性腫瘤之一。對(duì)化療有一定的敏感性。目前對(duì)骨肉瘤患者多采用以吡柔比星、順鉑、甲氨蝶呤和異環(huán)磷酰胺等綜合化療方法。關(guān)于具體的用藥方法和作用機(jī)制并未作深入的研究。本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)吡柔比星、順鉑、卡鉑、甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺等藥物對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株(MG-63)的細(xì)胞毒性及分子作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)的同時(shí)指導(dǎo)臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 材料 人成骨肉瘤細(xì)胞株(MG-63)取自河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院綜合實(shí)驗(yàn)中心;吡柔比星為深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;順鉑(批號(hào):8090162DB)、卡鉑(批號(hào):8110172ES)為齊魯制藥有限公司產(chǎn)品;甲氨喋呤(批號(hào):08082511)、異環(huán)磷酰胺(批號(hào):08062811)為江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品;無(wú)支原體胎牛血清為杭州四季青生物制品廠產(chǎn)品;使用的其他材料包括 MTT、DMEM培養(yǎng)基、二甲基亞砜、EDTA、胰蛋白酶、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、48孔培養(yǎng)板、0.22 μm微孔慮膜及加樣器。

1.2 方法

1.2.1 在 37℃、5%CO2、95% 空氣、飽和濕度下 CO2孵箱內(nèi)閉式傳代培養(yǎng)細(xì)胞，將傳代后第3天處于指數(shù)增殖期細(xì)胞經(jīng)EDTA和胰酶消化制成懸液后分別接種到3個(gè)48孔板上，每孔加90 μl的細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為1.5×104/ml)和10 μl的藥物。加入不同濃度的藥物，培養(yǎng)的時(shí)間分別為24、48、72 h。利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)。

1.2.2 經(jīng)上述處理，分別在 24、48、72 h 后加 MTT 10 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在平板離心機(jī)上離心10 min，2 000 r/min，棄上清液，加二甲亞砜 150 μl/孔，待結(jié)晶溶解后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)690 nm)測(cè)定每一孔的吸光度 A值(OD值)，并計(jì)算其細(xì)胞毒性指數(shù)值(CI)，CI=(對(duì)照組A值－試驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%。利用MTT法制作藥物濃度時(shí)間曲線。

1.2.3 利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期的分析。將濃度為0.4×106/ml的細(xì)胞懸液12 ml和不同濃度的吡柔比星、順鉑、卡鉑、甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺共同置于75 cm2的培養(yǎng)瓶分別培養(yǎng)24、48和72 h后將培養(yǎng)液連同用EDTA和胰蛋白酶消化下的骨肉瘤細(xì)胞一起離心、清洗，經(jīng)染色后行細(xì)胞周期分析，了解細(xì)胞的周期分布及細(xì)胞的增殖活性。

1.2.4 利用免疫印跡法檢測(cè)不同基因的變化情況。將濃度為0.4×106/ml的細(xì)胞懸液12 ml和不同濃度的吡柔比星、順鉑、卡鉑、甲氨蝶呤共同置于75 cm2的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞離心，于－20℃保存。配置凝膠后加樣電泳，并轉(zhuǎn)膜，分別加入一抗和二抗并進(jìn)行圖像分析

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，各組數(shù)據(jù)比較采用多因變量方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)學(xué)變化 倒置顯微鏡下觀察到骨肉瘤細(xì)胞(MG-63)與吡柔比星、順鉑、卡鉑、甲氨蝶呤培養(yǎng)基作用24 h后細(xì)胞增值數(shù)量減少，少量細(xì)胞壞死漂浮，48 h后漂浮細(xì)胞明顯增多，一部分胞膜破裂細(xì)胞壞死，存活細(xì)胞顏色晦暗，胞漿內(nèi)顆粒增多增粗，72 h后部分細(xì)胞漂浮，大部分細(xì)胞溶解。見圖1。

圖1 不同種類的化療藥不同時(shí)間對(duì)MG-63的抑制情況(HE×20)

2.2 MTT實(shí)驗(yàn) 不同濃度吡柔比星、順鉑、卡鉑、甲氨蝶呤對(duì)MG-63細(xì)胞分別作用24、48和72 h后，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)均起到抑制作用。不同時(shí)間組及不同濃度組與對(duì)照組相比，順鉑和卡鉑對(duì)MG-63細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制率也隨之增加，呈劑量-時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)生長(zhǎng)曲線顯示對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株卡鉑的濃度約需25倍于順鉑才能產(chǎn)生相似的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。見圖2。

圖2 不同種類的化療藥不同時(shí)間對(duì)MG-63的抑制生長(zhǎng)曲線

2.3 細(xì)胞周期分析顯示 不同濃度吡柔比星、順鉑、卡鉑作用骨肉瘤細(xì)胞24、48和72 h后收集細(xì)胞流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，在細(xì)胞各期均有不同的凋亡峰，細(xì)胞周期各期所占比例無(wú)明顯變化，抑制作用呈劑量依賴性。見圖3。

2.4 免疫印跡結(jié)果顯示 PCNA在與吡柔比星、順鉑、卡鉑、甲氨蝶呤作用的骨肉瘤細(xì)胞株表達(dá)與對(duì)照組相比較明顯下降，Bax表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，Bcl-2表達(dá)略減少。cyclin D1、cyclin E的表達(dá)明顯減少。見圖4。

3 討論

圖3 不同種類的化療藥不同時(shí)間對(duì)MG-63細(xì)胞株的抑制的流式分析

圖4 不同種類的化療藥不同時(shí)間對(duì)MG-63細(xì)胞株的蛋白免疫沉淀分析

骨肉瘤是兒童和青少年常見的骨惡性腫瘤，盡管早期手術(shù)和輔助化療使得患者預(yù)后有明顯的改善，但目前仍有28.4%的患者死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［1］。對(duì)于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，化療是惟一有效的治療方法，新輔助化療對(duì)提高骨肉瘤患者的5年生存率至關(guān)重要，但應(yīng)用歷史相對(duì)其他惡性腫瘤較短，化療藥物種類不多，探索合理化療方案成為當(dāng)前關(guān)鍵性問(wèn)題。吡柔比星是阿霉素的衍生物，治療骨肉瘤作用強(qiáng)于阿霉素，而心臟毒性明顯小于阿霉素，因而近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于臨床，但它對(duì)骨肉瘤細(xì)胞影響的機(jī)制目前尚無(wú)定論。本實(shí)驗(yàn)MTT和FMC結(jié)果顯示隨時(shí)間延長(zhǎng)不同濃度吡柔比星對(duì)細(xì)胞的最終抑制作用是一致的。凋亡峰最高時(shí)的濃度可能是最適濃度，凋亡峰最高的時(shí)間和濃度效果最佳。

增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)合成并存在于細(xì)胞核內(nèi)，是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，常作為測(cè)定細(xì)胞增殖水平的指標(biāo)，其在細(xì)胞核內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)的高低與細(xì)胞增殖活性密切相關(guān)。測(cè)定化療前后腫瘤細(xì)胞PCNA的表達(dá)，可以對(duì)化療效果作出評(píng)價(jià)。Nakashima等［2］用免疫組化的方法檢測(cè)26例骨肉瘤標(biāo)本，結(jié)果示PCNA的陽(yáng)性率為80.8%，并指出PCNA能較好地反映骨肉瘤組織的增殖能力，通過(guò)檢測(cè)PCNA在化療前后骨肉瘤組織中的變化，能預(yù)測(cè)術(shù)前化療的療效。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)吡柔比星、順鉑、卡鉑和甲氨蝶呤作用后PCNA蛋白表達(dá)均受抑制，表明可通過(guò)抑制PCNA表達(dá)使細(xì)胞增殖受限。另外，不同濃度吡柔比星、順鉑、卡鉑和甲氨蝶呤作用骨肉瘤細(xì)胞后細(xì)胞G0/G1比例呈先下降后上升趨勢(shì)，表明對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖周期G0/G1期延緩作用。蛋白印記法發(fā)現(xiàn)吡柔比星、順鉑、卡鉑和甲氨蝶呤分別作用48 h后與對(duì)照組相比較cyclin D1和cyclin E過(guò)表達(dá)均受抑制。通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的影響達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。

抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制方式有多種，如誘導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡，促進(jìn)細(xì)胞壞死等。近幾年腫瘤生物治療的熱點(diǎn)是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡而達(dá)到治療目的，此種療法稱為腫瘤的凋亡療法［3］，細(xì)胞凋亡受許多基因調(diào)控，Bcl-2基因是與細(xì)胞凋亡關(guān)系最為密切的凋亡抑制基因。Bax表達(dá)本身并不阻斷凋亡，而是具有對(duì)抗Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)蛋白印記法結(jié)果顯示吡柔比星、順鉑、卡鉑和甲氨蝶呤分別作用48 h后與對(duì)照組相比較Bcl-2表達(dá)率降低，Bax表達(dá)率升高。

本試驗(yàn)中PCNA在順鉑組和卡鉑組骨肉瘤表達(dá)與對(duì)照組相比較明顯下降，表明順鉑和卡鉑對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株抑制增殖作用明顯［4］。而Bax表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，Bcl-2表達(dá)略減少，結(jié)合倒置顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，說(shuō)明順鉑、卡鉑與骨肉瘤細(xì)胞作用后存在凋亡現(xiàn)象，但是未能形成凋亡峰，這可能與鉑類化合物能夠作用細(xì)胞生長(zhǎng)各個(gè)周期有關(guān)［5，6］。通過(guò)分析順鉑、卡鉑對(duì)骨肉瘤細(xì)胞各個(gè)生長(zhǎng)周期的影響及蛋白分子表達(dá)情況，肯定了卡鉑和順鉑對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株相似作用機(jī)制和細(xì)胞毒性反應(yīng)，了解了其具體作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

MTX是最早公認(rèn)的對(duì)骨肉瘤化療有效的藥物，對(duì)多種腫瘤具有良好的抗腫瘤活性，其作用機(jī)制為通過(guò)對(duì)二氫葉酸還原酶(DNA合成所需的重要酶)競(jìng)爭(zhēng)性抑制而抑制細(xì)胞DNA的合成發(fā)揮作用，是骨與軟組織腫瘤化療的首選藥物［7］，單藥有效率通常在20% ～30%，提高劑量可以克服腫瘤的耐藥性，增加組織壞死反應(yīng)率，但大劑量MTX治療可產(chǎn)生嚴(yán)重的甚至致命的毒性反應(yīng)，如肝功能損害、腎功能衰竭、骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、皮膚黏膜反應(yīng)以及因此而引發(fā)的繼發(fā)性感染、出血等。有關(guān)化學(xué)藥物作用的確切機(jī)制至今尚未完全清楚。隨著生物化學(xué)修飾的研究，特別是以此為依據(jù)的多制劑聯(lián)合療法中，制劑間的修飾作用，用藥劑量，投藥順序等方面的研究和應(yīng)用，使得腫瘤化療效果明顯提高，多種藥物聯(lián)合的意義在于將抑制于不同細(xì)胞周期的腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步殺滅。未來(lái)對(duì)骨肉瘤的治療以及預(yù)防肺轉(zhuǎn)移的手段在于多種藥物的聯(lián)合應(yīng)用，目前，我們正在尋找新的對(duì)骨肉瘤有效的藥物［8］。

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