替加環素對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌體外抗菌活性分析及聯合用藥研究

張曉玲 劉鵬 彭宗生 杜學娜

隨著臨床碳青霉烯類抗生素(如亞胺培南、美羅培南等)廣泛應用于鮑曼不動桿菌感染，鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥率也逐年提高，2012年的CHINET的流行病學調查顯示，顯示耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(carbapenem resistant acinetobacter baumannii，CRAB)占臨床分離的鮑曼不動桿菌50%以上。替加環素是臨床針對CRAB的一個新的選擇，同時有建議替加環素與其他抗生素聯合使用，以增加療效。本實驗采用CLSI推薦的檢測MIC的參考方法瓊脂稀釋法檢測替加環素對CRAB的MIC值。另外根據本院臨床用藥常規，應用肉湯微量稀釋棋盤法測定替加環素分別聯合氨芐西林舒巴坦和黏菌素對CRAB的MIC值，并計算部分抑菌濃度指數(fractional inhibitory concentration index，FICI)，以了解秦皇島地區替加環素對CRAB的體外藥物敏感性以及和氨芐西林舒巴坦、黏菌素E聯用的體外活性，為該藥在臨床上的使用提供體外藥物檢測依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集秦皇島市三家大型醫院2012年1月至2014年5月臨床分離的CRAB共51株，同一患者只收集一次菌株，以保證菌株的不重復性。對患者的臨床病歷進行評估，選擇有明確感染病例，同時記錄患者的科室、病種、年齡，是否接受侵入性操作等基本情況。按照CLSI 2012年M100-S21中折點判定標準厄它培南 MIC≥0.5 mg/L，美羅培南 MIC≥2.0 mg/L或亞胺培南MIC≥2.0 mg/L，判定為耐碳青酶烯類藥物菌株。質控菌株為:大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.2 抗菌藥物 替加環素標準粉(美國輝瑞制藥有限公司，批號:L28832-6)儲存于≤20℃冰箱內，避免反復凍融。美羅培南(住友制藥)，亞胺培南(杭州默沙東制藥有限公司)，厄他培南(杭州默沙東制藥有限公司)可立其丁(Sigma公司)，氨芐西林(中國藥品生物制品檢定所)，舒巴坦(哈爾濱制藥總廠)。

1.3 試劑與儀器 培養基Mueller-Hinton瓊脂和肉湯(英國Oxoid公司)，VITEK-32細菌鑒定儀(法國生物公司梅里埃)。

1.4 方法

1.4.1 替加環素 MIC值測定:藥敏試驗嚴格按照2009年《新型甘氨酰環素類抗菌藥物替加環素的體外藥敏試驗操作規程》〔1〕的要求采用肉湯稀釋法測定替加環素對CRAB的MIC值。根據《替加環素體外藥敏試驗操作規程專家共識》〔2〕，使用的M-H肉湯當天新鮮配制。另外由于替加環素理化性質活潑，試驗中配制M-H肉湯稀釋的藥物原液和稀釋的過程要嚴格避光，減少與空氣接觸的時間(黑布遮蓋，加蓋)。稀釋好的不同濃度的含替加環素的M-H培養基加橡膠塞密封置于培養箱中24 h觀察結果。目前CLSI沒有替加環素的藥敏結果判定標準，只給出了替加環素藥敏試驗中質控菌株可接受的質量控制范圍。本研究中CRAB應用大腸埃希菌ATCC25922的質控范圍0.03～0.25 mg/L。另外，由于 CLSI中尚無替加環素的MIC及折點判定標準，根據《替加環素體外藥敏試驗操作規程專家共識》，本研究中替加環素的折點采用FDA的折點判定標準:MIC≤2 mg/L為敏感，MIC≥8 mg/L為耐藥，MIC=4 mg/L為中介。采用WHONET 5.6軟件，建立藥敏結果數據庫并進行藥敏結果數據分析。

1.4.2 體外聯合藥敏實驗:肉湯微量稀釋棋盤法:從細菌培養皿上挑取提純的CRAB菌落2～4個，接種于M-H肉湯中增菌12 h，將增菌后的肉湯稀釋成0.5麥氏濁度。將替加環素，氨芐西林舒巴坦(氨芐西林、舒巴坦按2∶1)，黏菌素，根據美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)2012版執行標準分別倍比稀釋為1/32-4MIC。使用96孔U型板，按棋盤法設計，將已稀釋好的不同濃度的菌液和抗菌藥物兩兩加入孔中，最后留一孔不加抗生素作為陽性對照。37℃ 24 h觀察結果。結果判定部分:抑菌濃度(FIC)指數計算公式:FIC=FICA+FICB，其中FICA=MICA藥聯用/MICA藥單用，FICB 相同。協同:FIC≤0.5，相加:0.5 ＜FIC≤1，無關:1＜FIC≤4，拮抗:FIC＞4。

2 結果

2.1 51株CRAB來源分類 本研究檢測2012年1月至2014年5月秦皇島三所大型醫院112例鮑曼不動桿菌其中共51例CRAB占46%。對菌株來源進行統計，其中來源于ICU的CRAB 21例，都曾伴有侵入性操作，占41.2%。另外腫瘤患者合并感染14例，重度肺炎6例，外傷手術后感染患者3例，尿路感染3例，菌血癥2例，腹膜炎1例，重度糖尿病1例。見表1。

表1 51株CRAB來源分類

2.2 替加環素對51株 CRAB的體外抗菌活性和CRAB對替加環素的體外敏感率分布 51株CRAB中，對替加環素敏感共29株，占56.9%，中介共12株占23.5%，耐藥共10株占19.6%。可見替加環素對CRAB具備較好的體外抗菌活性。51株CRAB對替加環素的體外敏感率分布，MIC為2 mg/L時，敏感率達56.9%，MIC 為 4 mg/L，敏感率達 76.5%，MIC 為8 mg/L，敏感率達80.4%，MIC 為16 mg/L，敏感率達91.3%。MIC50 為2 mg/L，MIC90 為16 mg/L，具有較好的體外敏感率。見表2、3。

2.3 替加環素分別與氨芐西林舒巴坦、黏菌素E聯用，經棋盤法檢測并計算部分抑菌濃度指數(FICI)，替加環素+氨芐西林舒巴坦有協同作用4例占8%，相加作用15例占30%，無關32例占62%。而替加環素+黏菌素E的組合有6例相加(11%)，其余全部表現為無關。可見在協同率和相關率上替加環素+氨芐西林舒巴坦的組合優于替加環素+黏菌素E的組合。見表4。

表2 替加環素對51株CRAB的體外抗菌活性

表3 CRAB對替加環素的體外敏感率分布 %

表4 替加環素分別與氨芐西林舒巴坦、可立其丁聯用部分抑菌濃度指數(FICI) 例(%)

3 討論

隨著碳青霉烯類抗生素廣泛應用于鮑曼不動桿菌感染，鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥率也逐年提高。近年來，CRAB導致的感染呈全球蔓延趨勢，且廣泛分布于醫院感染患者的體液中，尤其是ICU病房中免疫力低下和有介入性操作的患者［3］。分析原因可能是ICU患者免疫力低下同時都伴有侵入性操作，而且長期應用抗生素，催生了CRAB。另外由于CRAB是院內感染的主要菌種，不可忽視的方面是ICU病房的消毒隔離措施以及醫務人員的手消毒是否到位等。秦皇島三所大型醫院112例鮑曼不動桿菌其中共51例CRAB占46%。秦皇島地區CRAB的流行趨勢不容樂觀。

針對CRAB，應用新的抗菌藥物或抗菌藥物組合越發重要。替加環素作為新一代超廣譜抗生素，是第一個被批準應用于臨床的甘氨酰環素類抗菌藥物，它的作用機制主要是通過與核糖體30S亞基結合從而抑制蛋白質的合成［4］。是目前少數對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌有抗菌活性的抗菌藥物之一。但研究表明替加環素的抗菌活性具有時間依賴性［5］，由于替加環素血藥濃度低，組織濃度較高，需要與其他抗菌藥物聯用。

鮑曼不動桿菌具有高度的天然固有耐藥性和獲得性耐藥性，治療鮑曼不動桿菌感染尤其是耐藥的鮑曼不動桿菌感染藥物選擇非常有限，非傳統藥物如多黏菌素等雖然對腎臟及神經系統有高毒性，但仍然可以作為藥物組合在臨床應用。研究表明，鮑曼不動桿菌容易對多黏菌素E產生異質性耐藥，但異質性耐藥菌株能夠部分恢復對其他抗菌藥物的敏感性，需聯合其他抗菌藥物如替加環素［6］。另外，對耐碳青霉烯類不動桿菌，其往往對含舒巴坦敏感，因為舒巴坦可以直接作用于細菌的PBP2，從而顯示出它對不動桿菌的獨特的殺菌作用［7］。

本研究顯示，替加環素對CRAB表現出較好的體外抗菌活性，對CRAB的體外敏感率達56.9%，成為僅次于多黏菌素的體外最有效的抗菌藥物。另外由于該藥在臨床用藥方便及與其它藥物無交叉耐藥，且肝腎毒性低等特點，使其在臨床抗感染治療中具有非常樂觀的前景。替加環素與氨芐西林舒巴坦聯用，協同加相關率可達到38%，優于替加環素與多黏菌素E聯用，在替加環素與多黏菌素E的組合中，除6例相關外，其余全部無關。

隨著替加環素在臨床使用的增加，需要快速、準確的藥敏結果指導臨床合理使用該類抗菌藥物。同時，做好替加環素和替加環素和其他抗生素的體外藥敏監測，為臨床科學、合理、高效的使用此藥提供支持，是臨床細菌工作者需要做的一項重要工作。

1 王輝，倪語星，陳民鈞，等.新型甘氨酰環素類抗菌藥物替加環素的體外藥敏試驗操作規程.中華檢驗醫學雜志，2009，32:1208-1213.

2 王輝，俞云松，王明貴，等.替加環素體外藥敏試驗操作規程專家共識.中華檢驗醫學雜志，2013，36:584-587.

3 張冀霞，王占偉，王啟，等.替加環素對臨床常見多重耐藥菌的體外抗菌活性研究.中華檢驗醫學雜志，2013，36:308-312.

4 杜小幸，王海萍，傅鷹，等.不同藥敏方法檢測替加環素對鮑曼不動桿菌敏感性的比較.中華檢驗醫學雜志，2013，36:598-599.

5 van Ogtrop ML，Andes D，Stamstad TJ，et al.In vivo pharmacodynamic activities of two glycyleyelines(GAR-936 and WAY 152，288)against various gram-positive and gram-negative bacteria.Antimierob Agents Chemother，2000，44:943-949.

6 Moffatt JH，Harper M，Harrison P，et al.Colistin resistance in Acinetobacter baumannii is mediated by complete loss of lipopo-lysaceharide production.Antimicrob Agents Chemother，2010，54:497l-4977.

7 張櫻，陳亞崗，楊青.不動桿菌感染及耐藥枧制的研究進展.國外醫學流行病學傳染病學分冊，2005，32:109-112.