補腎利濕法對急性痛風性關節炎大鼠血清hs-CRP和Dickkopf-1的影響

姜德友 袁潁超 劉春紅 謝 穎 韓潔茹 張 淼 馮 濤 陳 飛

（黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040）

補腎利濕法對急性痛風性關節炎大鼠血清hs-CRP和Dickkopf-1的影響

姜德友 袁潁超 劉春紅 謝 穎 韓潔茹 張 淼 馮 濤 陳 飛

（黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040）

目的：觀察補腎利濕法對急性痛風性關節炎大鼠血清超敏C反應蛋白（hs-CRP）和Dickkopf-1（DKK-1）表達水平的影響，探討補腎利濕法防治急性痛風性關節炎的機理。方法：將84只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、中藥對照組、西藥對照組及補腎利濕低、中、高劑量組，每組12只?？瞻捉M與模型組灌胃生理鹽水，中藥對照組和西藥對照組分別灌胃痛風舒片溶液和秋水仙堿溶液，補腎利濕低、中、高劑量組分別灌胃18.7、37.4、74.8mL/kg補腎利濕中藥復方，每日1次，連續7d。隨后除空白組外，其余各組大鼠采用尿酸鈉和氧嗪酸鉀誘導急性痛風性關節炎。造模4h后眼眶取血，分離血清，應用ELISA法，檢測各組大鼠血清中hs-CRP和DKK-1的含量。結果：模型組大鼠血清hs-CRP和DKK-1均明顯高于空白組（P＜0.01）。各給藥組大鼠血清hs-CRP含量均明顯低于模型組（P＜0.01），其中以西藥對照組和補腎利濕中劑量組效果最為明顯。各給藥組大鼠血清DKK-1含量與模型組比較無統計學差異。結論：補腎利濕中藥復方可降低急性痛風性關節炎模型大鼠血清hs-CRP水平，對防治急性痛風性關節炎具有一定作用；對降低DKK-1效果不明顯，可能與急性期血清中DKK-1表達特點有關，需要作進一步研究。

急性痛風性關節炎 補腎利濕 中藥復方 hs-CRP DKK-1 病理學 SD大鼠

痛風（gouty arthritis，GA）是嘌呤代謝紊亂及/或尿酸排泄減少所引起的一種代謝性疾病。臨床表現為高尿酸血癥和尿酸鹽結晶沉積所致的特征性急、慢性關節炎，病程日久可引起泌尿系結石或痛風性腎病，導致腎功能不全，嚴重影響患者健康狀況和生存質量[1]。急性痛風性關節炎（acute gouty arthritis）是痛風比較典型的表現形式。目前臨床仍以西藥為主來控制急性發作期的痛風性關節炎，如促尿酸排泄劑、抑制尿酸生成劑、秋水仙堿、激素等。此類藥物雖作用迅速，但副作用多、中毒率高，易引發腎功能損害、皮膚過敏甚至毒性上皮壞死等，因此眾多中醫學者開始重視研究開發防治痛風性關節炎安全有效的中藥制劑。本研究采用尿酸鈉聯合氧嗪酸鉀誘導大鼠急性痛風性關節炎模型，分別用秋水仙堿、痛風舒片和補腎利濕中藥復方進行預處理，觀察各組大鼠血清超敏 C反應蛋白 （hs-CRP）和Dickkopf-1（DKK-1）表達水平，探討補腎利濕法防治急性痛風性關節炎的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 選用健康雄性SD大鼠84只，體重（200±20）g，黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號:[SCXK（黑）2008004]。實驗對動物的處理方法符合中華人民共和國科學技術部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》[2]。

1.2 藥物與試劑 補腎利濕中藥復方由熟地黃20g、山藥15g、山茱萸20g、澤瀉15g、懷牛膝15g、萆薢20g、土茯苓30g組成[3]，方中藥材從黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院中藥房一次性選購。秋水仙堿購自西雙版納藥業有限責任公司，批號140807；痛風舒片（主要成分:大黃、車前子、澤瀉、川牛膝、防己）購自湖北綠金子藥業有限責任公司，批號140301；微量尿酸鈉結晶（批號CAS1198-77-2）、氧嗪酸鉀（批號CAS2207-75-2）均購自美國Sigma公司。hs-CRP試劑盒購于北京誠森生物技術有限公司，批號201501。

1.3 儀器 多用途高速臺式離心機 （貝克曼X-22R），電子分析天平（梅特勒公司AL204），酶標儀（Gene Company synergy H7），恒溫鼓風干燥箱（上海一恒，型號:DHG-9140A）。

2 實驗方法

2.1 動物分組 適應性喂養1周后將大鼠按隨機數字表隨機分為7組，每組12只，分別為空白組、模型組、中藥對照組、西藥對照組和補腎利濕低、中、高劑量組。

2.2 藥物溶液制備 （1）尿酸鈉溶液的制備:將1g微晶尿酸鈉結晶加9mL無菌生理鹽水，加熱攪拌，定容成10mL尿酸鈉溶液。（2）氧嗪酸鉀溶液的制備:將3g氧嗪酸鉀晶體溶解于97mL生理鹽水中，加熱攪拌，配置成3%氧酸鉀溶液。（3）痛風舒片溶液的制備:將痛風舒片研成細末，配置成0.029g/mL的痛風舒片溶液，4℃冰箱保存備用。（4）秋水仙堿混懸液的制備:將秋水仙堿片研成細末，配置成0.028mg/mL的秋水仙堿混懸液，4℃冰箱保存備用。（5）補腎利濕中藥復方溶液的制備:將熟地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、懷牛膝、萆薢、土茯苓入砂鍋中加4倍體積的水浸泡30min，煎2次，30min/次，去渣，兩煎混合，G4濾器過濾，于60℃水浴中加熱，分別將原藥液1.87mL、3.74mL、7.48mL濃縮成1mL，密封隔水煮沸消毒，置4℃冰箱保存備用。

2.3 給藥方法 以每100g大鼠體質量灌胃1mL為標準，空白組和模型組分別灌胃等量生理鹽水，中藥對照組和西藥對照組分別灌胃痛風舒片溶液和秋水仙堿溶液，補腎利濕低、中、高劑量組分別給予補腎利濕中藥復方18.7、37.4、74.8mL/kg灌胃，各組均每日灌胃1次，連續7d，末次給藥后造模。

2.4 造模方法 用3%氧嗪酸鉀溶液 （15mL/kg）進行腹腔內注射，15min后將大鼠仰臥固定，碘伏消毒右后肢小腿膝關節，用BD針在大鼠右后肢膝關節右后側從30°～40°方向插入至肌腱內側，有落空感后，注入10%尿酸鈉溶液0.2mL，制備急性痛風性關節炎模型?？瞻捉M右后肢膝關節注射等體積生理鹽水。

2.5 血清樣本采集 造模4h后眼眶取血，室溫下放置30min，3500r/min離心15min，分離血清，-4℃冰箱凍存待測。

2.6 hs-CRP、DKK-1含量測定 取血清上清液，采用酶聯免疫吸附法 （ELISA）測定血清中hs-CRP、DKK-1的濃度，具體步驟按照試劑盒說明書進行。

2.7 關節滑膜組織病理學檢查 用銳利刀片取受試關節滑膜組織，95%乙醇固定，梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察關節滑膜組織病變。

2.8 統計學方法 采用 SPSS17.0統計軟件進行數據分析。組間比較采用One-Way ANOVA分析，多組樣本均數間比較選擇單因素方差分析，采用LSD-t檢驗，所有計量資料用（±s）表示。P＜0.05為有統計學差異。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠血清hs-CRP、DKK-1含量比較 結果見表1。與空白組比較，模型組大鼠hs-CRP、DKK-1水平明顯增高（P＜0.01）。與模型組比較，各用藥組hs-CRP水平均明顯降低（P＜0.01），提示各組藥物均對降低hs-CRP水平有作用。其中，西藥對照組和補腎利濕中劑量組效果更明顯，此2組間比較無統計學差異（P＞0.05）。血清DKK-1水平方面，與模型組比較，補腎利濕中劑量組和西藥對照組均有較大程度的降低趨勢，但無統計學差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠血清hs-CRP、DKK-1含量比較（±s）

表1 各組大鼠血清hs-CRP、DKK-1含量比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與西藥對照組比較，△P＜0.05；與中藥對照組比較，▲P＜0.05。

組別 動物數（只） 劑量hs-CRP（μg/L）DKK-1（μg/L）空白組120.39±0.02 0.93±0.04模型組 12 0.89±0.06**1.06±0.11**中藥對照組 12 2.9×10-1g/kg 0.69±0.07**##1.05±0.06**西藥對照組 12 2.8×10-4g/kg 0.49±0.05**##▲0.98±0.09補腎利濕低劑量組 12 18.7mL/kg 0.63±0.06**##△1.06±0.14**△補腎利濕中劑量組 12 37.4mL/kg 0.48±0.04**##▲0.97±0.07補腎利濕高劑量組 12 74.8mL/kg 0.63±0.05**##△1.02±0.07

3.2 病理組織學觀察 空白組大鼠關節滑膜細胞形態規則，排列整齊。模型組滑膜細胞排列不整，表面滲出，有不同程度的壞死，滑膜組織內見有尿酸鹽結晶體，結合血尿酸測定，提示造模成功。中藥對照組滑膜組織仍見水腫、壞死、大量中性粒細胞浸潤，炎性滲出減輕。西藥對照組滑膜組織仍有水腫炎細胞浸潤，滲出不明顯。補腎利濕低劑量組滑膜組織仍有明顯水腫，炎細胞浸潤；中劑量組滑膜組織輕度水腫，滲出減輕，少量炎細胞浸潤；高劑量組滑膜組織仍見有退變、水腫、大量中性粒細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠關節滑膜病理組織學圖片（HE染色，×400）

4 討論

急性痛風性關節炎歸屬于中醫學痹證范疇。醫圣張仲景所著《金匱要略》中提及“歷節”，與本病癥狀相似，后世醫家多沿用此病名，并根據其痛勢劇烈的特點稱之為“白虎風”、“歷節風”。近代醫家認為本病病因多由于人體遭受風寒、濕熱之邪侵襲，致氣血、經絡受病邪閉阻而引起關節紅腫熱痛、畸形等癥。我們根據多年臨床經驗，詳審本病病機，認為痛風應從腎論治[4]。腎主水，且為一身陰陽之根本，人身水液代謝雖有多種臟器參與，歸根結底全賴腎陽蒸騰氣化作用。若先天不足或后天調養不當引起腎臟虧虛，以致腎不溫化，濕濁內泛，久蘊不去，釀生濁毒，加之外受風寒濕熱之邪，內有七情勞倦之災，或關節外傷，天虛人虛，兩害交加，濕濁隨氣機運行無處不到，流注關節、肌肉則為痹為痛?！端貑枴ぬ庩柮髡摗吩啤皞跐裾?，下先受之”，指出了急性痛風性關節炎臨床癥狀以下肢關節受累為主的原因。綜上所述，急性痛風性關節炎屬本虛標實，以腎臟虧虛為本，氣滯、血瘀、濕聚、痰凝、熱蘊雜合為標，治以補腎利濕法。補腎利濕中藥復方由資生腎氣丸化裁而來，方中熟地黃氣味厚重以滋陰補腎、填精益髓，山茱萸酸、微溫以補益肝腎、收斂固澀，兩藥配合，肝腎并補，取“肝腎同源”之意，加入山藥補脾益氣，三藥合用，意在三陰并補，復其在內之真陰。純用補益之劑，味厚而有壅滯之弊，難免事倍功半，根據本病補腎之治法，加入澤瀉利濕以泄腎濁，調和熟地滋膩之性，另據現代藥理學研究指出，澤瀉有明顯的利尿和抗炎作用[5]。萆薢利濕去濁，祛風除痹；土茯苓清熱解毒，除濕通絡；牛膝活血通經，舒筋利痹，引血下行，利尿通淋。上三味藥對于氣、血、濕濁多有通利作用，以針對本病在標之氣滯、血瘀、濕濁為患。諸藥配伍，標本兼治。

作為中藥對照組的痛風舒片，主要藥物為大黃、車前子、澤瀉、川牛膝、防己，功用清熱、利濕、解毒，治標為主，雖祛邪但由于不能扶正，忽略了腎臟虧虛之本，所以療效有限。臨床中常用的治療急性痛風性關節炎的西藥是秋水仙堿，其消炎止痛作用顯著，但是副作用較大，尤其是胃腸道反應。

急性痛風性關節炎發作機制十分復雜，現代研究認為:高尿酸血癥狀態易形成尿酸鹽結晶，作為異物觸發機體固有免疫反應，導致關節及周圍組織的急性炎癥反應。hs-CRP是一種炎癥因子，是反映機體炎癥過程的靈敏指標[6]?，F代研究表明，血清中hs-CRP含量在風濕性疾病時會升高，升高的原因在于炎癥反應和組織損傷，且hs-CRP水平與其損傷程度成正比[7]。劉國生等[8]的研究表明，血清中hs-CRP水平對痛風性關節炎的發作與轉歸具有一定的相關性，可作為痛風性關節炎診療的一項新指標。另外，Wnt pathway在骨與關節形成和破壞中通過幾個抑制性的分泌型分子起到關鍵的調控作用，DKK-1是其中最重要的抑制劑[9]。趙衛等[10]的研究結果表明，血清中的尿酸和沉積于骨組織中的尿酸鹽共同作用導致骨破壞，DKK-1是參與原發性痛風性關節炎骨破壞的重要因子之一。由于研究較少，DKK-1在急性期痛風性關節炎期的表達特點尚有爭論。

本實驗通過測定各組大鼠血清中hs-CRP和DKK-1的含量，證實補腎利濕法中藥復方能降低痛風性關節炎模型大鼠血hs-CRP的表達，從而緩解紅、腫、熱、痛等炎癥癥狀；對Wnt途徑抑制劑DKK-1的表達具有一定抑制作用，有減少軟骨及骨質破壞的可能性。這可能是補腎利濕中藥復方治療急性痛風性關節炎眾多機制中的一種。但是，由于有關DKK-1在急性痛風性關節炎大鼠模型中的具體表達過程尚不是十分明確，補腎利濕中藥復方對其作用不太明確的原因仍需要進一步進行實驗研究。

[1] 張眾.中西藥聯用治療濕熱蘊結型原發性急性痛風36例臨床研究.江蘇中醫藥，2011，43（6）：30

[2] 中華人民共和國科學技術部.《關于善待實驗動物的指導性意見》的通知 [EB/OL].[2006-09-30]http：//www.most. gov.cn/fggw/zfwj/zfwj2006/200609/t20060930_54389.htm

[3] 王俊霞，韓潔茹，周雪明.姜德友從腎論治痛風經驗.上海中醫藥雜志，2010，44（2）：16

[4] 姜德友，安偉濤，謝穎，等.補腎利濕法治療痛風性關節炎療效觀察.新中醫，2012，44（10）：35

[5] 沈映君.中藥藥理學.北京：人民衛生出版社，2002：433

[6] 胡艷立，朱偉斌.血清超敏C反應蛋白對痛風的診斷價值.海南醫學，2012，23（3）：95

[7] He P，Xie XH，Ding YP，et al.Correlation between high sensitive C-reactive protein，lipoprotein（a），blood uric acid and severity of coronary artery disease.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2010，90（28）：1989

[8] 劉國生，周發為，唐生堯，等.超敏C反應蛋白在痛風性關節炎診療中的價值.湖北民族學院學報 （醫學版），2014，31（3）：22

[9] Miller JR.The Wnts.Genome Biol，2002，3（1）：3001

[10] 趙衛，高輝，朱佳鑫，等.血清Dickkopf-1與原發性痛風性關節炎骨破壞的相關性.北京大學學報 （醫學版），2012，44（2）：254

R289.7

A

1672-397X（2015）07-0077-03

姜德友（1960—），男，醫學博士，教授，博士研究生導師，從事經方治療疑難雜癥與龍江醫派研究。

陳飛，醫學博士。chenfei0622@126. com

2015-04-30

編輯：吳 寧

國家自然科學基金項目（81173170）