PEG 修飾青蒿素脂質(zhì)納米粒的體外釋放及抗巨噬細胞攝取特性

欒淑偉，趙 青，程慧芳，王銳利，梁桂賢，張淑秋

山西醫(yī)科大學藥學院，太原 030001

青蒿素(artemisinin，ART)是從植物黃花蒿中提取分離得到的具有內(nèi)過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯類化合物［1］，為目前治療瘧疾的一線藥物。該類藥物因其特殊的化學結(jié)構(gòu)，可減少血液中傳播瘧疾的瘧原蟲配子體，主要作用于膜系結(jié)構(gòu)，干擾了瘧原蟲的表膜-線粒體功能，阻斷了宿主紅細胞漿對瘧原蟲的營養(yǎng)供給，具有良好的臨床效果。青蒿素在水中幾乎不溶，現(xiàn)有的制劑主要有油針、片劑、栓劑等。本課題組將其制成青蒿素脂質(zhì)納米粒(artemisinin nanostructured lipid carrier，ART-NLC)，制成凍干粉穩(wěn)定性好，靜脈注射給藥后血藥濃度平穩(wěn)。

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(NLC)靜脈注射給藥存在一些問題:可被單核巨噬細胞(mononuclear phagocyte macrophage，MPM)吞噬，體內(nèi)循環(huán)時間短，限制了其靶向給藥。為了克服上述問題，充分利用NLC 的載藥優(yōu)勢，對其表面修飾成為近年來研究NLC 的熱點［2］。其中用聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)或其衍生物對NLC 進行表面修飾的研究日益活躍，并將有良好的前景。由于PEG 分子的親水性和柔順性，PEG 修飾后NLC 將較少受到調(diào)理素的調(diào)理，進而減少其被MPM 識別吞噬的機會，體內(nèi)循環(huán)時間延長，稱為長循環(huán)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(PEGNLC)［3］。PEG-NLC 具有長循環(huán)特性，再借助NLC控釋作用，可以延長載藥粒子在血液循環(huán)滯留時間，從而增強藥物在血液循環(huán)系統(tǒng)中的被動靶向性和療效［4］。

由于PEG-NLC 的表面特性等理化性質(zhì)是影響其體內(nèi)命運的關(guān)鍵因素［5］。本研究在本實驗室先前工作的基礎(chǔ)上，構(gòu)建3 種不同聚合度的聚乙二醇硬脂酸酯(PEGn-SA，n=25、40、55)表面修飾的青蒿素脂質(zhì)納米粒(PEGn-ART-NLC)，探討PEGn-ART-NLC 的體外釋放及巨噬細胞(J774)攝取特性，為靜脈注射PEG-NLC 長循環(huán)給藥系統(tǒng)提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

青蒿素原料藥(ART，重慶華立武陵山制藥有限公司，純度99.0%～101.0%，批號C00120130510);青蒿素標準品(中國食品藥品檢定研究所，批號20100609);中鏈甘油酸三酯(MCT，德國薩索爾);單硬脂酸甘油酯(GMS，天津市光復(fù)精細化工研究所，批號20130326);PEGn-硬脂酸酯(n=25、40、55)(梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司);聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH40，上海運宏化工制劑輔料有限公司);泊洛沙姆188 (F68，德國巴斯夫);純化水(Heal Force);巨噬細胞細胞株(J774，中科院上海細胞庫);DMEM 培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)、胎牛血清(fetal bovine serum)購自Gibco公司;乙腈、甲醇(色譜純，山東禹王試劑有限公司，批號2013061005);其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

高效液相色譜儀(美國Agilent 1200);馬爾文粒度儀(Malvern，1079008);高壓乳勻機(APV-2000);高速分散均質(zhì)機(上海標本模型廠，F(xiàn)J-200);臺式離心機(上海安亭科學儀器廠，TDL-5-A);HY-2 調(diào)速多用振蕩器(江蘇中大儀器廠);FA1104N 電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司);85-2 數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(榮華儀器制造有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 ART-NLC 的制備

PEGn-ART-NLC 和ART-NLC 的處方見表1，處方篩選及工藝優(yōu)化工作將另文報道。制備方法均采用高壓乳勻法。

表1 PEGn-ART-NLC(n=25、40、55)及ART-NLC 處方組成Table 1 Formulations of ART long-circulating nanostructured lipid carriers (PEGn-ART-NLC，n=25，40，55)and ART nanostructured lipid carrier (ART-NLC)

1.3.2 ART 體外含量測定

采用本實驗室已建立的HPLC-柱后衍生化-UV檢測方法［6］測定ART 含量。青蒿素分子結(jié)構(gòu)內(nèi)無共軛基團，僅在紫外區(qū)203 nm 處有較弱的末端吸收。與堿反應(yīng)后，分子內(nèi)的過氧橋結(jié)構(gòu)被破壞，重排形成共軛結(jié)構(gòu)，產(chǎn)物在289 nm 處有最大吸收。由于反應(yīng)有堿存在，損壞色譜柱，不宜直接進樣，因此選用柱后衍生化法進行測定。

色譜條件如下:色譜柱:C18液相色譜柱(5 μm，150 mm×4.6 mm);流動相:乙腈-0.1 mol/L 醋酸鹽緩沖鹽(77∶23);流速:流動相0.7 mL/min，柱后衍生試劑(1 mol/L KOH 90%乙醇溶液)0.2 mL/min;柱溫:30 ℃;柱后反應(yīng)溫度:70 ℃;進樣量:20 μL;檢測波長:289 nm。

1.3.3 體外釋放實驗

1.3.3.1 釋放介質(zhì)的選擇

為研究ART-NLCs 體外釋放規(guī)律，經(jīng)試驗選用pH 7.4 磷酸鹽緩沖液(PBS)作釋放介質(zhì)。

1.3.3.2 ART-NLCs 體外釋放

分別精密量取各ART-NLCs 溶液1 mL，置于預(yù)先處理好的透析袋(截留相對分子質(zhì)量1～1.2 萬)中，平行操作3 份，扎緊袋口后，完全放入裝有200 mL pH 7.4 PBS 溶液的磨口三角錐瓶中，封口，于(37 ±0.5)℃，100 rpm 恒溫振蕩。在設(shè)定的不同時間點1、2、3、4、6、8、12、24、36、48 h 分別取樣2 mL，同時補加(37 ±0.5)℃空白釋放介質(zhì)2 mL。48 h后，將透析袋取出剪開，轉(zhuǎn)移到10 mL 容量瓶中，加入5 mL 乙腈，超聲5 min 使NLC 完全破乳，乙腈定容。以該溶液作為時間無窮大時刻的樣品。0.45 μm 微孔濾膜過濾樣品，取續(xù)濾液20 μL，按“1.3.2”項HPLC-柱后衍生化-UV 檢測方法測定藥物濃度。

1.3.3.3 考察透析袋對釋放的影響

用乙腈配制1.5 mg/mL ART 溶液，精密量取該溶液1 mL，置于預(yù)先處理好的透析袋(截留相對分子質(zhì)量1～1.2 萬)中，按“1.3.3.2”項下操作進行。

1.3.3.4 考察血漿對釋放的影響

另精密量取各ART-NLCs 溶液1 mL，置于預(yù)先處理好的透析袋(截留相對分子質(zhì)量1～1.2 萬)中，隨即加入0.5 mL 人血漿，混合均勻，按“1.3.3.2”項下操作進行。

1.3.3.5 體外釋放計算公式

按公式F(%)=mi/mo×100%(1)計算累計釋放量。其中F 為累計釋放量，mi為每個時間點的累計藥物含量，mo為ART-NLCs 中藥物的含量。

1.3.4 J774 細胞體外攝取實驗［7］

1.3.4.1 J774 細胞混懸液的制備

用含10%胎牛血清(FBS)DMEM 吹打混懸細胞，稀釋至細胞數(shù)1 ×105/mL。

1.3.4.2 PEGn-SA 聚合度對J774 細胞體外攝取的影響

于離心管中分別加入J774 細胞懸液1 mL 和樣品0.5 mL(PEGn-ART-NLC 或ART-NLC)(n=5)，以0.5 mL 雙蒸水作為對照組，于(37 ±0.5)℃水浴中50 rpm 振搖30 min，取出后在冰浴中終止吞噬，離心(1000 rpm，5 min)，棄去上清液。用pH 7.0 的PBS 分次洗滌，離心，棄去上清后得J774 細胞樣品。

取離心分離后得到的J774 細胞樣品，依次加入乙腈400 μL，超聲粉碎(超聲時間1 s，間隔1 s，超聲30 次)，3500 rpm 離心15 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾樣品上清液，取續(xù)濾液20 μL，按“1.3.2”項HPLC-柱后衍生化-UV 檢測方法測定藥物濃度。上式中Wt為加入藥物的總量，WU為J774 細胞攝取的藥物量。

1.3.4.3 蛋白吸附對J774 細胞體外攝取的影響

另取J774 細胞懸液1 mL，樣品0.5 mL (PEGn-ART-NLC 或ART-NLC)及血漿0.5 mL，按“1.3.4.2”項下操作進行。

1.3.4.4 孵育時間對J774 細胞體外攝取的影響

在(37 ±0.5)℃分別孵育0.5、1、2 h，按“1.3.4.2”項下操作進行。

1.3.5 估算水化層的厚度［7］

NLC 表面覆有柔順的PEG 長鏈，親水性的PEG鏈上具有很多親水位點，可吸附大量水分形成一層水分子的空間位阻，稱為固定水化層［8］。利用Gouy-Chapmann 擴散雙電層模型，估算固定水化層厚度(Fixed aqueous layer thichness，F(xiàn)ALT)，公式如下:

其中，ξ 為Zeta 電位的絕對值，A 為常數(shù)，K 為Debye-Hückel 參數(shù)，等于，C 為電解質(zhì)的濃度，L為FALT/nm。

以0、0.01、0.05、0.1 mol/L 的NaCl 電解質(zhì)溶液將ART-NLC、PEG25-ART-NLC、PEG40-ART-NLC和PEG55-ART-NLC 稀釋，測得Zeta 電位，代入公式3 求算L。

2 結(jié)果與討論

2.1 ART 體外含量測定

ART 在2～20 μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標準曲線為A=63.468x+9.7071，r=0.9999。

ART 高、中、低3個濃度(18、10、5 μg/mL)的平均回收率分別為99.6%、99.4%、99.3%(n=3)。日內(nèi)精密度(RSD)0.32%、1.17%和1.70%(n=5)，日間RSD 0.67%、1.45%和1.82%(n=3)。

表2 ART-NLCs 的包封率及載藥量(n=3)Table 2 Entrapment rate and drug-loading rate of ART-NLCs (n=3)

ART-NLCs 的包封率及載藥量見表2。

2.2 體外釋放實驗

2.2.1 考察透析袋對釋放的影響

ART 溶液在4 h 內(nèi)基本完全透過透析袋，并測得藥物溶液體外釋放透析袋回收率，為(99.8 ±0.90)%，結(jié)果表明，透析袋對ART 脂質(zhì)納米粒的釋放無限速作用。

2.2.2 PEGn-SA 聚合度對體外釋放的影響

按“1.3.1”項下處方，考察PEGn-SA 的加入量不變，PEG 聚合度n 分別為25、40、55 時，PEG25-ART-NLC、PEG40-ART-NLC、PEG55-ART-NLC、ARTNLC 及青蒿素溶液的體外釋放曲線，結(jié)果見圖1(A)。加入血漿后以上各制劑的體外釋放曲線，結(jié)果見圖1(B)。

圖1 青蒿素體外釋放曲線:(A)PEGn-ART-NLC(n=25、40、55)、ART-NLC 和青蒿素溶液在PBS 中的釋放曲線;(B)PEGn-ART-NLC(n=25、40、55)和ART-NLC 在加入人血漿的PBS 中的釋放曲線(n=3)Fig.1 In vitro release profiles of ART:(A)Release profiles of ART from PEGn-ART-NLC (n=25，40，55)，ART-NLC and ART solution in PBS;(B)Release profiles of ART from PEGn-ART-NLC (n=25，40，55)and ART-NLC in PBS with human plasma (n=3)

由圖1 中A、B 可見，隨PEGn-SA 聚合度增大，PEGn-ART-NLC(n=0、25、40、55)體外釋放增加，48 h 內(nèi)分別釋放了94%、76%、80%、87%。加入人血漿后，ART-NLC、PEGn-ART-NLC 均比在未加入血漿的PBS 中釋放加快;但隨PEGn-SA 聚合度增大，PEGn-ART-NLC(n=0、25、40、55)體外釋放減少，48 h 內(nèi)分別釋放了88%、69%、64%、60%。

采用透析與血漿透析兩種方法研究ART-NLCs體外釋放，結(jié)果表明不加血漿PEGn-ART-NLC(n=25、40、55)三種制劑釋放度隨PEGn-SA 聚合度的增大而增加，其原因可能是NLC 表面的PEGn-SA 聚合度越大，親水性越強，使得藥物與NLC 膠體溶液擴散層的親和力增大，更易于釋放。血漿的加入使得ART-NLC、PEGn-ART-NLC(n=25、40、55)四種制劑釋放速度均明顯加快，其主要機理可能是由于血漿中多種蛋白成分迅速吸附于NLC 表面，發(fā)生相互作用，影響了脂質(zhì)的膜穩(wěn)定性，導(dǎo)致藥物通透性有所增加;血漿中其他成分如酶也可能促進藥物從NLC中的釋放速度。但PEGn-ART-NLC 與血漿混合釋放度降低的原因可能是PEGn-SA 插嵌到NLC 的表面，形成一層厚厚的“云層”，避免了納米粒之間的聚集，并阻止其他聚合物與之發(fā)生相互作用，使PEGn-ART-NLC 膜更加穩(wěn)定，從而使藥物不易被釋放出來［9］。

2.3 J774 細胞體外攝取實驗

與ART-NLC 相比，J774 細胞對PEGn-ART-NLC的攝取量明顯減小(P＜0.01)，并受PEGn-SA 聚合度的影響，PEGn-SA 含量一定時，PEGn-ART-NLC 與J774 細胞37 ℃孵育分別0.5、1、2 h 后，J774 細胞對PEGn-ART-NLC 的攝取量均隨PEGn-SA 聚合度增大而降低。其中J774 細胞對PEG55-ART-NLC 的攝取量明顯小于PEG40-ART-NLC 和PEG25-ART-NLC(P＜0.01)。

J774 細胞對PEGn-ART-NLC 和ART-NLC 的體外攝取作用受孵育時間的影響，攝取量隨孵育時間的延長而增大。分別在1 h 和2 h 后出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.01)。

J774 細胞對ART-NLCs 體外細胞攝取作用受蛋白吸附的影響，與不加血漿相比，加入血漿后各試管中J774 細胞對ART-NLCs 的攝取量均明顯增大(P＜0.01)，其中J774 細胞對PEG25-ART-NLC 的攝取量要明顯大于PEG40-ART-NLC 和PEG55-ART-NLC(P＜0.01)。J774 細胞與ART-NLCs 孵育不同時間后，各時間點可見，與不加血漿相比，加入血漿后各試管中J774 細胞對PEGn-ART-NLC 和ART-NLC 的攝取量均明顯增大(P＜0.01)。

J774 細胞對PEGn-ART-NLC 和ART-NLC 的攝取結(jié)果見表3，圖2。

表3 ART-NLCs 與J774 細胞37 ℃孵育0.5 h 后攝取量的比較(n=5)Table 3 In vitro uptake of ART-NLC and PEGn-ART-NLC by J774 at 37 ℃(n=5)

圖2 37 ℃J774 細胞與ART-NLCs 分別孵育0.5、1、2 h后的攝取量(n=5)Fig.2 Uptake of ART-NLCs by J774 after incubation at 37℃for 0.5，1 and 2 h (n=5)

體外巨噬細胞攝取實驗是體外評價PEG-NLC長循環(huán)能力的常用方法［3］。

機體MPS 系統(tǒng)識別異物的機制為［9］:當異物進入體內(nèi)后多種蛋白成分迅速吸附于納米粒表面。若增加納米粒的表面親水性，就可減少調(diào)理素(蛋白質(zhì))的吸附，因此PEG 的親水性柔韌長鏈及其高密度覆蓋層是減小蛋白吸附的必要條件。

J774 細胞對PEGn-ART-NLC 與ART-NLC 的攝取量相比，PEGn-SA 表面修飾的NLC 表現(xiàn)出顯著的抗吞噬性，可能是用PEGn-SA 對ART-NLC 進行表面修飾后，PEG 長鏈的柔韌性使PEGn-ART-NLC 的空間結(jié)構(gòu)時刻發(fā)生變化而使J774 細胞難以對其產(chǎn)生有效的識別，從而使J774 細胞對PEGn-ART-NLC的攝取減少。一般而言，PEG 長鏈的長度越長，其柔韌性越好，其抵抗細胞攝取的作用越強，本實驗可見隨PEGn-SA(n=25、40、55)聚合度增大，J774 細胞對PEGn-ART-NLC 的攝取量增加。高哲等［10］的研究獲得了同樣的結(jié)果，可能與PEGn-ART-NLC 具有較厚的表面固定水化層和較高的PEG 鏈密度和較強的干擾蛋白吸附到脂質(zhì)納米粒表面的能力有關(guān)［7］。

2.4 固定水化層厚度的估算

以0、0.01、0.05、0.1 mol/L 的NaCl 電解質(zhì)溶液稀釋PEG25-ART-NLC、PEG40-ART-NLC 和PEG55-ART-NLC，測得Zeta 電位結(jié)果見表4。根據(jù)公式3將lnξ 對進行線性回歸，見圖3，其斜率即為L。ART-NLC、PEG25-ART-NLC、PEG40-ART-NLC 和PEG55-ART-NLC 的固定水化層厚度L 分別為0.31、1.76、1.86 和2.04 nm。

表4 ART-NLCs 在不同NaCl 濃度下的Zeta 電位Table 4 Zeta potential of ART-NLCs in different concentrations of NaCl

圖3 lnξ 對的線性回歸Fig.3 Regression of lnξto

L 是影響PEG 表面修飾長循環(huán)給藥系統(tǒng)的重要表面性質(zhì)，增加L 可顯著延長粒子的體內(nèi)循環(huán)時間。PEGn-SA 含量相同時，隨著PEGn-SA 聚合度的增加，PEGn-ART-NLC Zeta 電位(絕對值)減小，L增大，體外J774 細胞攝取減少。可見PEGn-SA 對ART-NLC 的修飾作用，與PEGn-SA 在ART-NLC 表面的空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

根據(jù)Needham 的模型［11］，L 可體現(xiàn)PEG 鏈在納米粒表面的長度;Needham 認為，PEG 可在納米粒表面形成“線型”或“蘑菇”樣的構(gòu)型，在線性構(gòu)型中，PEG 鏈是舒展的，理論上聚合度為40 的PEG 線型構(gòu)型的鏈長為16.7 nm，而實際上，PEG 鏈在納米粒表面往往以彎曲、折疊、壓縮的形式存在，即“蘑菇”樣構(gòu)型，PEG25-ART-NLC、PEG40-ART-NLC 和PEG55-ART-NLC 形成的固定水化層分別僅有1.76 nm、1.86 nm 和2.04 nm;“蘑菇”樣構(gòu)型對PEGn-ART-NLC 有兩方面的影響:其一，PEG 鏈減少了其擺動的可能性，也就是說PEG 鏈的柔韌性下降;其二，表觀上增加了單位PEG 鏈對納米粒表面的覆蓋面積，從而一定程度上增加了保護作用［12］。

本研究為構(gòu)建PEGn-SA 表面修飾的NLC 長循環(huán)給藥系統(tǒng)提供了理論和實驗依據(jù)，下一步本文擬進行不同PEGn-ART-NLC 體內(nèi)動力學的比較性研究，證明PEG 表面修飾青蒿素脂質(zhì)納米粒具有長循環(huán)作用，將另文報道。

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