籽瓜皮多酚的提取及其抑菌作用研究

劉忠義，彭 麗，包 浩，譚 操，劉文平

湘潭大學化工學院食品與生物工程系，湘潭 411105

籽瓜(Citrullus lanatus ssp.Vulgaris convar.megalaspermus Lin et Chao)系葫蘆科西瓜屬植物，為普通西瓜的栽培變種，原產于非洲，現在我國甘肅等地大量種植，具有較高的營養、保健和經濟價值［1-3］。傳統上，籽瓜常用于取籽，其皮和瓤被大量丟棄，在一定程度上造成了資源的浪費。從自然資源中獲取天然活性成分，已成為當前的研究要點。研究顯示，籽瓜多酚具有一定的抗氧化和抗腫瘤活性，然而籽瓜多酚的其他活性鮮見報道。多酚廣泛分布于植物、水果蔬菜中［4］，具有較高的保健和經濟價值，在醫藥、食品、日用品等行業［5］都有很高的利用價值。本文以籽瓜皮為原料，通過超聲波輔助提取多酚，并通過高效液相色譜(HPLC)鑒定籽瓜皮多酚提取物的主要成分，通過微生物培養法探討其抑菌作用，旨在為籽瓜皮、囊的深加工利用提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

籽瓜摘自湘潭籽瓜實驗種植基地，選取成熟無破損的籽瓜，清洗干凈，去除綠衣和瓜瓤，將瓜

皮打漿粉碎，于-80 ℃超低溫冰箱中保存，使用前置于4 ℃的冰箱中融解備用。大腸桿菌由湘潭大學微生物實驗室保藏提供。

1.2 藥品與試劑

BHT、乙醇、Na2CO3、FeSO4等均為分析純;沒食子酸標準品(色譜純，批號:MUST-11122813)，成都曼思特生物科技有限公司;福林酚試劑，合肥博美生物科技責任有限公司;氨芐西林，市售。

1.3 儀器與設備

Forma-86ULT 型超低溫冰箱(美國Thermo 公司)，GL21M 高速冷凍離心機(長沙英泰儀器有限公司)，尤尼RE-2000A 型旋轉蒸發儀(上海雅榮生化設備儀器有限公司)，WFZ UV-2802SH 型紫外可見分光光度計(上海柯儀器有限公司)，QTR3120 型超聲波清洗機(天津市瑞普電子儀器公司)，XW-80A微型旋渦混合器(上海碩光電子科技有限公司)，BHC-1300ⅡA2 生物安全柜［阿爾泰實驗室設備(北京)有限公司］。

2 實驗方法

2.1 多酚的測定

多酚的測定采用Folin-Ciocalteu 比色法，以沒食子酸作為標準物，參照文獻［6］所介紹的方法，適當改動。分別準確量取0.1 mg/mL 沒食子酸標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于10 mL 比色管中，各加6 mL 水，混合均勻，加入0.5 mL 福林酚試劑，搖勻。3 min 之后，加入200 g/mL 碳酸鈉溶液1.0 mL，超純水定容。30 ℃水浴條件下反應30 min，于740 nm 波長下測定吸光度，所有樣品平行操作三次，建立標準曲線。

2.2 超聲波輔助提取條件確定

按不同的料液比，準確稱取一定量的籽瓜皮漿于燒瓶中，加入不同體積分數的乙醇，將燒瓶放入超聲波機中，在不同的溫度下提取不同的時間。每次提取后，收集提取液，抽濾，濃縮，按照2.1 所述方法測定其多酚含量。多酚得率按下式計算:

W=m/M

其中，W:多酚提取率，mg/g;M:樣品質量，g;m:籽瓜皮多酚含量，mg。

在單因素實驗的基礎上，設計L9(34)正交實驗，考察提取時間、乙醇濃度、提取溫度、料液比對樣品中多酚提取率的影響，優化出超聲波輔助提取多酚的最佳工藝參數。L9(34)正交實驗因素與水平設計見表1。

表1 L9(34)正交因素與水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

2.3 籽瓜皮多酚主要成分測定

稱取10 mg 沒食子酸標準品，溶于100 mL 容量瓶中，得0.1 mg/mL 沒食子酸標準液，以此標準液配制不同濃度的沒食子酸系列標準液，經液相色譜得到沒食子酸液相色譜圖。籽瓜皮多酚提取物，經離子沉淀法純化及與提取液等體積的乙酸乙酯萃取三次之后，濃縮至1 mL。經0.45 μm 微孔濾膜過濾后進色譜柱，根據保留時間定性，外標法定量，進行籽瓜皮多酚主要成分分析。色譜柱Inertsil ODS-SP C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL/min;進樣量:20 μL;檢測器:spd-m20a 光電二極管陣列檢測器;檢測波長:280 nm。流動相:乙腈(A)，質量分數0.4%甲酸溶液(B);梯度洗脫程序:0～5 min，25%A;5.01～10.00 min，80%A;10.01～15.00 min，10%A，15.01～25.00 min，25%A。

2.4 籽瓜皮多酚的抑菌實驗

籽瓜多酚的大腸桿菌抑菌實驗參照文獻［7］完成。采用牛肉膏蛋白胨固體培養基。吸取0.1 mL預先培養并制好的菌懸液，加入到約15 mL 未凝固已滅菌的培養基中，震蕩混合均勻，倒入插有牛津杯的培養皿，培養基凝固后，于牛津杯中加入0.2 mL 0.4 mg/mL 的經過乙酸乙酯萃取的籽瓜皮多酚提取液，然后入恒溫箱37 ℃培養48 h。2 mg/mL 氨芐西林做陽性對照，0.9%生理鹽水做陰性對照。

2.5 籽瓜皮多酚最低抑菌濃度測定

采用牛肉膏蛋白胨液體培養基。在無菌條件下，取無菌試管10 支(15×100 mm)，每管加入液體培養基2 mL，在第1 管加入0.4 mg/mL 籽瓜皮多酚提取液2 mL，連續倍比稀釋至第8 管，并從第8 管中吸取2 mL 棄去，第9 管為細菌生長對照，第10 管為藥物對照。在每管內加入制備好的菌懸液0.1 mL。接種完畢后，置于37 ℃恒溫培養箱培養24 h。肉眼觀察，不發生混濁變化的最高提取物稀釋倍數即為該提取物的最低抑菌濃度。

2.6 數據處理

所有試驗均采用三次平行試驗的平均值，圖用Origin(Pro)7.5 繪制，數據間差異用SPSS13.0 進行方差分析和多重比較，結果以平均值±標準偏差表示。

3 結果與分析

3.1 多酚標準曲線

按1.3.1 所述方法，進行測定，利用Origin7.5分析得標準曲線回歸方程為:A=0.01794+91.18452C，R=0.99946。式中:A 為吸光度，C 為濃度，mg/mL。

3.2 不同提取條件對多酚提取率的影響

選用70 mL/100 mL 的乙醇，料液比1∶5，在40℃溫度下超聲波輔助提取，探討不同提取時間對提取率的影響。實驗結果見圖1A。由圖1A 看出:隨著提取時間的增加，多酚提取率增加;然而，提取時間達到40 min 之后，隨著提取時間增加多酚的提取率反而降低。這和橄欖［8］、西蘭花［9］和板栗總苞［10］等多酚提取時所得結果一致。由于酚羥基易被氧化，超過一定提取時間，其某些活性被破壞［11］，故提取時間對多酚提取率的影響存在閾值。

圖1 提取時間(A)、乙醇濃度(B)、提取溫度(C)和料液比(D)對多酚提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time(A)，ethanol concentration(B)，extraction temperature(C)and ratio of solid to liquid(D)on yield of polyphenols

選用料液比1∶5，溫度40 ℃，提取時間40 min，超聲波輔助提取，研究不同乙醇濃度對提率的影響。由圖1B 看出:隨著乙醇濃度的增大，多酚提取率增加;當乙醇濃度超過70 mL/100 mL 之后，多酚的提取率隨乙醇體積濃度增加反而降低。此結果與桑葉多酚的提取實驗結果基本一致［12］，與橄欖［8］、西蘭花［9］和板栗總苞［10］等多酚提取時所呈現的趨勢相同，但最佳乙醇濃度有一定差別。這表明醇濃度對多酚的提取率存在影響，且很可能是由于70 mL/100 mL 的乙醇與籽瓜多酚的極性相近，因而籽瓜多酚在70 mL/100 mL 的乙醇中溶解度較高［13］。

選用料液比1∶5，乙醇濃度70 mL/100 mL，提取時間40 min，超聲波輔助提取，探討不同提取溫度對提率的影響。實驗結果見圖1C。由圖1C 看出:隨著提取溫度數的增大，多酚提取率增加;當提取溫度超過60 ℃之后，多酚的提取率隨溫度增加而降低。究其原因可能是由于多酚不穩定，溫度高時多酚物質分解［14］。由圖1C 還可知，提取溫度對多酚提取率的影響存在閾值，甘薯渣中多酚［14］、西蘭花多酚［9］、板栗總苞多酚［10］提取時最佳溫度分別為80、50、65 ℃。溫度對多酚的提取存在一定影響，但對不同的原料，其多酚種類和含量及其存在狀態存在差別，故溫度的影響不同，導致最佳提取溫度差別較大。

選用乙醇濃度70 mL/100 mL，溫度60 ℃，提取時間40 min，超聲波輔助提取，探索不同料液比對提取率的影響。實驗結果見圖1D。由圖1D 看出:隨著料液比的增大，多酚提取率增加;當料液比超過1∶10 之后，多酚的提取率隨料液比增加反而降低。一方面由于水的用量過少，有效成分不能很好的溶出，而另一方面水的用量過多，雜質成分含量增多，使多酚相對含量減少［12］。由圖可知，料液比對多酚提取率的影響存在閾值，這一結果與西蘭花多酚［9］、板栗總苞多酚［10］、生姜多酚［14］提取時所得結果相同。但對于不同的原料，最佳的料液比不同，這可能與原料的結構、組成以及含水量有關。

3.3 多酚提取條件的優化

正交實驗結果見表2。由表2 直觀觀察，2 號實驗即提取時間為35 min，乙醇濃度為70 mL/100 mL，提取溫度為60 ℃，料液比為1∶10 時，多酚的提取率最高。而根據K 值分析得出最優因素水平組合為A1B2C2D1，即提取時間為35 min，乙醇濃度為70 mL/100 mL，提取溫度為60 ℃，料液比為1∶12。通過極差分析，可以看出料液比對多酚提取率的影響最大、時間次之，溫度的影響較小，乙醇濃度影響最小。最優因素水平組合未直接出現在正交表中，故需對最優條件進行實驗驗證。

取正交表中2 號實驗的工藝條件和最佳組合工藝條件進行實驗，每組實驗平行3 次，取平均值。2號實驗的提取率為33.21±0.89 mg/g，最佳組合的提取率為38.37±1.02 mg/g。結果表明，優化的因素水平組合A1B2C2D1的提取效果優于2 號實驗的因素水平組合。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of the orthogonal test

3.4 籽瓜皮多酚主要成分

經測定，HPLC 能夠較好地檢測沒食子酸(見圖2A)，其標準曲線為y=-72522.8+56624.2x，R=0.99674，P＜0.0001，線性關系良好，能夠用于定量分析。且該方法回收率為95.21%，標準偏差為0.55%，說明該方法準確可靠。圖2B 表明，雖然樣品峰有明顯拖尾及尾部凸出，仍然可以確定籽瓜皮多酚的主要成分是沒食子酸。沒食子酸是植物多酚的重要組成成分之一［6，15］，具有優越的抗氧化功能及諸多功能性質。

3.5 籽瓜皮多酚的抑菌效果

籽瓜皮多酚的抑菌實驗結果見圖3。結果表明，在接種大腸桿菌菌懸液的培養皿的滴加籽瓜皮多酚提取液的牛津杯周圍形成明顯的抑菌圈(圖3A)，而陰性對照滴加生理鹽水的牛津杯周圍沒有抑菌圈產生(圖3C)，這表明籽瓜皮多酚提取物具備抑制大腸桿菌生長的作用。經測定，0.4 mg/mL 籽瓜皮多酚提取液形成的抑菌圈大小約為12.6±0.3 mm，低于2 mg/mL 氨芐西林溶液產生的36.5±0.4 mm 的抑菌圈(圖3B)。這說明籽瓜皮多酚提取液具有明顯的抑菌效果。由于籽瓜皮多酚提取物的主要成分為沒食子酸，故很容易理解籽瓜皮多酚的抑菌作用。

圖2 沒食子酸標準品(A)及籽瓜皮多酚提取物(B)的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of gallic acid standard(A)and polyphenol extract of seed watermelon peel(B)

圖3 籽瓜多酚(A)、氨芐西林(B)及生理鹽水(C)的抑菌效果Fig.3 Anti-bacterial effect of polyphenol extracts of seed watermelon peel(A)，ampicillin(B)and normal saline(C)

3.6 籽瓜皮多酚的最低抑菌濃度

籽瓜皮多酚的最低抑菌濃度實驗結果見表3。由表3 可知，當籽瓜皮多酚濃度大于0.1 mg/mL，由于受到籽瓜皮多酚的抑制，大腸桿菌不能良好生長，故試管中培養基不出現渾濁現象，當籽瓜皮多酚濃度稀釋至0.05 mg/mL 時，大腸桿菌表現出微弱的生長態勢，故試管中培養基略微出現渾濁現象，當籽瓜皮多酚濃度繼續稀釋至0.0125 mg/mL 及以下時，大腸桿菌受到的抑菌程度很微弱，試管中培養基明顯出現渾濁現象。由實驗結果初步推斷籽瓜皮多酚的最低抑菌濃度為0.05 mg/mL。

表3 籽瓜皮多酚提取液的最低抑菌濃度(n=3)Table 3 Minimal inhibitory concentration of polyphenol extract of seed watermelon peel(n=3)

4 討論與結論

超聲波由于誘導空化作用而有助于低溫下提取植物中的有效成分，故超聲波輔助提取在食品相關領域中得到比較廣泛的應用［16］。超聲波輔助提取籽瓜皮多酚有比較好的效果，經過試驗得到籽瓜皮多酚的最佳提取條件為提取時間為40 min，乙醇濃度為70 mL/100 mL，提取溫度為60 ℃，料液比為1∶12。

籽瓜皮多酚提取液的主要成分為沒食子酸，這對進一步研究并理解籽瓜多酚提取液的抗氧化、抗菌等功能性質及其構效關系具有重要的意義。單寧類物質包括單寧(即沒食子酸)、縮合單寧及復合單寧是很多植物中多酚類物質的主要成分［6，15］。沒食子酸具有多個酚羥基，這是其具有優異抗氧化功能的結構基礎。

籽瓜皮多酚對大腸桿菌具有明顯抑制作用，其最低抑菌濃度經初步測定為0.05 mg/mL。大腸桿菌是食品中必須檢測的微生物指標，是食品衛生的重要指標之一。大腸桿菌經常被用做抑菌研究實驗對象［7］。目前，國內外對天然植物源性防腐劑研究異常活躍，本研究顯示籽瓜皮多酚有望發展成為一種天然防腐劑。

1 Shao MM(邵苗苗)，Li N(李娜)，Zhao B(趙兵)，et al.Research on health value of seed watermelon.Ningxia Agrecul Forest Sci Technol(寧夏農林科技)，2012，53:86-87.

2 Liang Q(梁琪).Composition analysis of the seed melon pulp and peel from different regions in Gansu province.J Gansu Agric Univ(甘肅農業大學學報)，1999，34:79-83.

3 Wang CP(王翠平).The antioxidant and antitumor activity of seed watermelon.Anhui Agric Sci(安徽農業科學)，2011，39:17833-17836.

4 Song LJ(宋立江)，Di Y(狄瑩)，Shi B(石碧).The significance and development trend in research of plant polyphenols.Prog Chem(化學進展)，2000，12:161-170.

5 Wang D(王棟)，Kang J(康健).Function，extraction and applications of tea polyphenols.J Xinjiang Univ，Nut Sci Ed(新疆大學學報，自科版)，2007，24:217-221.

6 Min FQ(閩凡芹)，Zhang ZH(張宗和)，Qin Q(秦清)，et al.Optimization of vaccum civitation extraction of tannic acid from Chinese gallnut using response surface method.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2013，25:1240-1244.

7 Liu AJ(劉安軍)，Li HY(李海燕)，Wang YX(王云霞)，et al.Antimicrobial on E.coli activities of polysaccharide from Walnut kernel pellicle.Modern Food Sci Tech(現代食品科技)，2010，27:29-31.

8 He ZY(何志勇).The isolation，purification and structure research of olive phenolic compounds.Wuxi:Jiangnan University(江南大學)，PhD.2007.

9 Meng LY(孟麗媛)，Wang FW(王鳳舞).Extraction technology and antioxidant activity of broccoli polyphenols.J Chin Inst Food Sci Tech(中國食品學報)，2013，13(5):62-67.

10 Shi EH(石恩慧)，Li H(李紅)，Gu MC(谷明燦)，et al.The process conditions optimization of the ultrasonic extraction of chestnut involucre polyphenols using response surface method.J Chin Inst Food Sci Tech(中國食品學報)，2013，13(5):69-76.

11 Song L(宋蕾).Extraction optimization and biological activity research of polyphenols and volatile oil from thistle kadsura.Shanghai:Fudan University(復旦大學)，PhD.2007:28-39.

12 Ding SH(丁雙華)，Ye LB(葉立斌)，Chen W(陳衛)，et al.Optimization extraction of mulberry leaf polyphenol using response surface method.J Chin Inst Food Sci Tech(中國食品學報)，2012，12:52-58.

13 Huang D，Ou B，Prior RL.The chemistry behind antioxidant capacity assays.J Agric Food Chem，2005，53:1841-1856.

14 Tang SR(唐仕榮)，Li C(李超)，Song H(宋慧)，et al.Optimization extraction and antioxidant property of ginger polyphenols.Sci Tech Food Ind(食品工業科技)，2010，4:256-259.

15 Zhou L(周磊)，Xu M(許敏)，Yang CR(楊崇仁)，et al.The advance of chemical components and bioactivity of fagaceous plants.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2012，24:260-273.

16 Vilkhu K，Mawson R，Simons L，et al.Application and oppor-tunities for ultrasonic assisted extraction process in food industry.Innov Food Sci Emerg Tech，2008，9:161-169.