金針菇菌渣中多糖的微波輔助提取工藝及其抗氧化活性研究

張 斌，劉 瑩，王 益，王延鋒，黃 文*

1 華中農業大學食品科技學院，武漢 430070;2 黑龍江省農業科學院牡丹江分院，牡丹江 157041

金針菇(Flammulina velutipes)隸屬真菌門，層菌綱，傘菌目，口磨科，金錢菌屬，是一種藥食兩用菌。金針菇具有免疫調節和抗腫瘤等活性，被認為具有很高的藥用價值，多糖為其中的一種重要活性成分。許多學者對金針菇子實體多糖和菌絲體多糖的提取工藝、結構特征和功能活性進行了研究［1］，而對金針菇菌渣中多糖的研究卻很少。金針菇菌(F.velutipes Residue)即收獲金針菇子實體后剩下的廢料，其中含有一些菌絲體生長的代謝產物，多糖為其中的一種。我國是世界上食用菌生產大國［2］，目前我國產量已占有世界總產量的70%左右，其中金針菇是我國栽培數量最多的食用菌之一。我國工廠化栽培金針菇近二十年，目前全國金針菇日產量在400噸左右，每年產生的菌渣至少有400 萬噸［3］。菌渣已成為數量十分可觀的重要資源。然而，每年大量的菌渣，除少量被用作飼料和再栽培外［4］，大部分當作廢料被浪費掉。鑒于此，本文采用響應面分析法優化微波輔助提取金針菇菌渣中多糖的工藝，并研究其體外抗氧化活性，旨在為金針菇菌渣的有效利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金針菇菌渣來自湖北省武漢市;DPPH、ABTS 購于上海源葉生物科技有限公司;維生素C 購于上海琳帝化工有限公司;石油醚、苯酚、無水乙醇、濃硫酸、氯仿、無水乙醇等均購于國藥集團化學試劑有限公司。

UV-2450 型紫外-可見分光光度計，上海亞研電子有限公司;Avanti J-E 高速冷凍離心機，美國Beckman Coulter 公司;HH-6 數顯恒溫水浴鍋，上海申勝生物科技有限公司;RE-2000 A 旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠;D8023CSL-K4 微波爐，廣州格蘭仕有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 金針菇菌渣多糖的制備工藝

金針菇菌渣60 ℃烘干后粉碎過60 目篩子，用石油醚(30～60℃)脫脂后，烘干備用。稱取備用的菌渣干粉5.0 g，加適量蒸餾水，在微波下作用一定時間后，將樣品于10000 rpm 離心10 min，濾液適當濃縮，加入適量體積的無水乙醇，混勻，置4℃冰箱中過夜，取出后抽濾，所得沉淀用無水乙醇、氯仿、無水乙醚反復洗滌3 次，冷凍干燥得到粗多糖。

1.2.2 菌渣多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定菌渣中多糖的含量［5］。根據試驗所得回歸方程y=0.0131x+0.0143，R2=0.9985 計算樣品多糖的含量，從而得到每個試驗組菌渣中多糖得率。多糖得率/%=(多糖含量g/菌渣質量g)×100%

1.2.3 單因素試驗

單因素試驗選取微波時間、微波功率和料液比三個因素，各因素選取五個水平，如表1 所示。

表1 單因素實驗的因素及水平Table 1 Levels and factors for single factor experiments

1.2.4 響應面試驗

響應面試驗因素及水平見表2。

表2 響應面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface analysis

1.2.5 對比試驗

分別采用微波輔助法與熱水浸提法進行金針菇菌渣中多糖的提取試驗，比較兩種方法對金針菇菌渣中多糖得率的影響。

1.2.6 金針菇菌渣中多糖的抗氧化活性的研究

分別測定了金針菇菌渣中多糖的還原能力［6］、清除ABTS+自由基的能力［7］和清除羥自由基的能力［8］。

2 結果與分析

2.1 金針菇菌渣多糖提取單因素試驗

2.1.1 微波時間對多糖得率的影響

在微波功率640 W，料液比1∶30 的條件下，考察不同微波時間對菌渣中多糖得率的影響，結果如圖1 所示。120 s 之前菌渣多糖得率隨著微波時間的延長不斷提高，在120 s 時達到最大。120 s 之后，微波時間過長，樣品中積蓄的能力過多，可能導致多糖的水解，從而多糖得率下降。因此選擇120 s 為最佳微波時間。

圖1 微波時間對多糖得率的影響Fig.1 The effect of microwave time on yield of polysaccharide

2.1.2 微波功率對多糖得率的影響

在微波時間120 s，料液比為1∶30 的條件下，考察不同微波功率對多糖得率的影響，結果如圖2 所示。隨著微波功率的增大，多糖得率提高，當微波功率為640 W 時，多糖得率最大;但隨著微波功率的繼續增大，多糖得率反而下降。這可能是由于微波功率在一定范圍內時，隨著微波功率的增大，提取體系吸收的能量增加，分子運動加劇，溶出物增加，多糖得率提高;但微波功率過大時，會引起體系局部高溫，破壞多糖結構，得率下降［9］。故選擇640 W 為最佳微波功率。

圖2 微波功率對多糖得率的影響Fig.2 The effect of microwave power on yield of polysaccharide

2.1.3 料液比對多糖得率的影響

在微波時間120 s，微波功率640 W 時，考察料液比對菌渣中多糖得率的影響，結果如圖3 所示。隨著料液比的增大，菌渣中多糖得率逐漸提高，料液比為1∶25 時，多糖得率達到最大值;料液比再增加，多糖得率基本保持不變。這說明一定范圍內的料液比的增大有利于多糖溶出，當料液比達到一定值時，多糖的溶出量已經達到最大限度，此時料液比繼續增大，對多糖得率影響不大。而且過大的料液比造成能源和資源的浪費，且不利于下一步試驗的進行［10］。

圖3 料液比對多糖得率的影響Fig.3 The effect of solid-to-liquid ratio on yield of polysaccharide

2.2 金針菇菌渣多糖提取響應面試驗

2.2.1 響應面試驗回歸模型的建立與分析

在單因素的基礎上，為了進一步確定影響多糖得率的主次因素及其因素之間的交互作用。根據Box-Behnken 中心組合實驗設計原理，設計了微波時間、微波功率和料液比的三因素三水平中心組合實驗，方案和結果如表3 所示。

表3 三因素三水平中心組合實驗方案及結果Table 3 Three factors and three levels of central composite experiment scheme and results

應用軟件Design Expert 8.0 對表3 的數據進行分析，建立了三元二次響應面回歸方程:Y=-12.26625+0.085858A+0.031700B+0.33225C-1.30208E-005AB-1.66667E-004AC+1.46875E-004BC-3.15556E-004A2-2.52539E-005B2-7.96000E-003C2。

由回歸模型數據分析得到，微波輔助提取菌渣多糖的最佳工藝為微波時間115.34 s，微波功率673.10 W，料液比1∶25.88，多糖得率的預測值為7.65%。考慮到實際的試驗操作條件，將提取工藝修正為微波時間115 s，微波功率640 W，料液比1∶26。在此條件下，試驗三次取平均值得菌渣多糖得率為7.53%，與預測值7.65%比較相近。

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance for the developed regression equation

由表4 可以看出，回歸模型極顯著(P＜0.0001)，說明回歸方程是可用的;失擬項僅為0.025，而且對應的P=0.1829＞0.05，說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小;R2=0.9880 說明預測值與實測值之間有高度的相關性。綜上得，該回歸方程可用于菌渣中多糖得率的優化。由F 值可以得出，影響菌渣多糖得率的各因素的主效關系為微波功率(B)＞微波時間(A)＞料液比(C)，其中微波時間(B)為極顯著，微波功率為顯著，料液比(C)為不顯著。

2.2.2 因素間的交互作用分析

圖4 為由回歸模型得到的響應面圖形，反應了兩兩因素之間對多糖得率的交互影響。

圖4 兩因素交互作用對多糖得率的影響Fig.4 Response surface plots showing the effect of two factors on yield of polysaccharide

由圖4a 可以看出，微波時間和微波功率的響應面坡度比較陡峭，等高線排列緊密且呈橢圓，說明微波功率和微波時間之間的交互作用明顯。微波功率的等高線比微波時間的等高線密集，說明微波功率的主效大于微波時間［10］。為了避免過長的微波時間導致多糖結構破壞，選擇120 s 左右為最佳時間段。

由圖4b 可以看出，等高線排列略疏松且橢圓曲率比較小，說明料液比和微波時間之間的交互作用不明顯。由于料液比對多糖得率的影響比較小，為了方便后續工作，把料液比選擇在適中水平。

由圖4c 可以看出，等高線排列緊密且呈橢圓，說明料液比和微波功率之間的交互作用比較明顯。微波功率的等高線明顯比料液比的等高線密集，說明微波功率的主效大于料液比。在微波功率640 W左右和料液比約1∶25 時，多糖得率達到最大值。

綜上得，微波功率的主效最明顯，微波時間和料液比次之。與回歸模型分析結果一致。

2.3 兩種方法提取菌渣多糖的對比試驗

微波輔助提取法和熱水浸提法分別提取金針菇菌渣多糖，用苯酚-硫酸法測定菌渣中多糖含量。

微波輔助提取法參照1.2.1 的論述。

熱水浸提法［11］:料液比1∶20，浸提溫度90 ℃，浸提時間3 h。

表5 兩種方法的效果比較Table 5 Comparison of two methods

從表5 可以看出，微波輔助提取法的提取時間僅為115 s，熱水浸提法的提取時間為3 h，前者明顯比后者費時少，而且微波輔助提取法的多糖得率比熱水浸提的多糖得率提高了15.14%。微波輔助提取法的這些優點恰好可以滿足即時、高效地處理每天產生的大量金針菇菌渣。

2.4 抗氧化能力

2.4.1 還原能力測定

樣品還原力通過將Fe3+/K3［Fe(CN)6］轉變為Fe2+的能力測定，吸光值越大，還原力越強，還原力大小可以間接評價樣品抗氧化能力的強弱。金針菇菌渣中多糖的還原力如圖5 所示。

圖5 金針菇菌渣中多糖的還原力Fig.5 The reducing powers of polysaccharides from F.velutipes residue

由圖5 可知，一定濃度范圍內，隨著多糖濃度的增加，其還原力增強。根據擬合曲線y=0.006x-0.004，R2=0.998，可以看出在一定濃度范圍內，多糖濃度與還原力之間具有一定線性關系，而且得到菌渣中多糖還原力的IC50值為8.4 mg/mL。在濃度0～10 mg/mL 范圍內，菌渣多糖的還原力低于Vc，這可能是由于多糖是大分子物質，還原性末端相對較少。

2.4.2 ABTS+自由基清除能力測定

ABTS+自由基水溶液呈藍綠色，在734 nm 處有最大吸收，當遇到具有抗氧化活性的物質時則被還原，溶液顏色變淺，吸光值降低，吸光值越小，表明樣品清除ABTS+自由基的能力越強。金針菇菌渣中多糖清除ABTS+自由基能力如圖6 所示。

圖6 金針菇菌渣多糖的ABTS+自由基清除能力Fig.6 ABTS+ radical-scavenging activities of polysaccharides from F.velutipes residue

由圖6 可知，多糖濃度在0～2 mg/mL，ABTS+自由基清除率顯著增大，繼續增大樣品濃度，清除率增加平緩。根據擬合曲線y=0.242 In(x)+0.540，R2=0.981，計算金針菇菌渣中多糖對ABTS+自由基的IC50值為1.01 mg/mL。在濃度0～6 mg/mL 范圍時，多糖的清除率略低于Vc 的清除率，繼續增大濃度，兩者的清除率相當，而且都基本接近100%。

2.4.3 羥自由基清除能力測定

羥自由基是活性很強的自由基，可引起細胞損傷，從而導致機體衰老或癌變等。因此，生物體為防御疾病，必須清除羥自由基。金針菇菌渣中多糖清除羥基自由基能力如圖7 所示。

圖7 金針菇菌渣多糖的羥基自由基清除能力Fig.7 OH radical-scavenging activities of polysaccharides from F.velutipes residue

由圖7 可知，多糖濃度在0～4 mg/mL，ABTS+自由基清除率顯著增大，繼續增大樣品濃度，清除率趨于平緩。根據擬合曲線y=-0.016x2+0.251x+0.038，R2=0.985，計算金針菇菌渣多糖對羥基自由基的IC50值為1.95 mg/mL。在濃度0～4 mg/mL時，多糖的清除率低于Vc 的清除率，繼續增大濃度，兩者的清除率相當，而且都基本接近100%。

3 結論

本文采用微波輔助法提取金針菇菌渣中多糖，此方法能夠高效、快速地將多糖物質溶出。而且在微波時間、微波功率和料液比三個單因素試驗的基礎上進行了響應面試驗優化，得到提取金針菇菌渣最優的工藝參數:微波時間115 s，微波功率640 W，料液比1∶26。菌渣中多糖得率為7.53%，與預測值7.65%接近。

本研究還對優化工藝下提取的多糖的體外抗氧化活性進行了評價，測定了此多糖的還原力、清除ABTS+自由基和清除羥基自由基的能力，多糖對還原力、ABTS+自由基和羥基自由基的IC50值分別為8.40、1.01 mg/mL 和1.95 mg/mL，且都具有一定得濃度依賴性。此結果表明金針菇菌渣中多糖具有一定的抗氧化能力，作為一種新的、天然的抗氧化劑具有良好的開發前景。

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