深海來源真菌Penicillium sp.F00120 代謝產物的研究

田永奇 ，林秀萍 ，劉 娟，王俊峰，楊 斌，鞠志冉，陶華明，劉永宏

1中國科學院南海海洋研究所 中國科學院熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室，廣州 510301;2中國科學院大學，北京 100049;南方醫科大學中醫藥學院，廣州 510515

經過60 多年的不懈努力，海洋天然產物研究已經有了長足的進步，藥學家們不斷地從海洋生物中分離出結構新穎，活性良好的化合物，超過0.1%的化合物已作為新藥的先導化合物。鎮痛藥物Ziconotide、抗腫瘤藥物ET-743 和抗腫瘤藥物HaLichondrin B 等海洋藥物的相繼上市標志著海洋天然產物在新藥研發中占據了重要的位置［1］。海洋微生物與海綿、珊瑚并列成為海洋天然產物的三大來源［2］。由于海洋真菌具有次級代謝產物豐富、活性多樣和易于發酵培養等優點，成為發現新的海洋活性天然產物的寶庫。迄今為止，已經從海洋真菌的發酵產物中發現了1000 多個新化合物。這些代謝產物都表現出良好的抗腫瘤、抗菌、抗病毒和神經心血管等活性［3］。

深海的高壓、低溫等極端環境賦予了深海真菌獨特的個性。深海真菌的次級代謝產物以結構新穎，活性良好著稱，目前已經成為藥學家們關注的熱點。2012年，本學科組從深海沉積物來源的真菌Penicillium sp.F00120 中分離得到了一個結構新穎的倍半萜醌類化合物penicilliumin A［4］。該化合物具有抗腫瘤活性，是迄今為止報道的少數幾個來源于微生物的倍半萜醌類化合物之一。本文作為此工作的延續，采用高鹽培養基進行發酵，從Penicillium sp.F00120 的發酵產物中分離得到了9 個化合物，通過核磁共振、文獻對照等方法鑒定了這些化合物的結構，其中化合物6 和7 為penicilliumin A 的同系物。

1 儀器與材料

核磁共振波譜儀:Brucker Avance DRX500 型(500/125 MHz，TMS 為內標)。HR-ESI-MS:Bruker micro TOF-QII mass spectrometer(Bruker，F?llanden，Switzerland)。EYELAN-1000 型旋轉蒸發儀。高效液相色譜儀:Agilent 1200(泵型號:G1212C，紫外檢測器型號:G1315D)，YMC-Pack(C8 250 × 10 mm I.D.S-5 μm，12 nm)。TLC:高效薄層層析板(HPTLC)為德國Merck 公司產品和煙臺江友硅膠開發有限公司產品。顯色劑:10%硫酸香蘭素溶液。常用有機試劑均為國產的分析純產品。

海洋真菌菌株F00120 從采自中國南海北部(Lat.22°6.017'N，Long119°17.440'E)1300 m 的海底沉積物樣品分離得到，經形態特征和分子生物學鑒定，確定其屬于青霉屬，并命名為Penicillium sp.F00120［4］。該菌株現保存于中國科學院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室。

2 真菌發酵

將保藏于4 ℃斜面的Penicillium sp.F00120 接種到MB 固體培養基(麥芽浸膏1.5 g，粗海鹽1 g，瓊脂粉1.5 g，蒸餾水100 mL，pH 7.4～7.8)平板上，于25 ℃培養箱中培養7 d。將活化后的菌株轉接到裝有10 mL MB 液體培養基(麥芽浸膏1.5 g，粗海鹽1 g，蒸餾水100 mL，pH 7.4～7.8，加玻璃珠)的100 mL 三角瓶中，于28 ℃、180 rpm 搖床培養2 d。將10 mL 種子培養液轉接入裝有大米固體培養基(大米200 g，粗海鹽6 g，自來水200 mL)的1000 mL 三角瓶中，于25 ℃靜置培養60 d，共發酵培養30 瓶。

3 提取與分離

Penicillium sp.F00120 的固體發酵物用丙酮浸泡過夜，攪拌粉碎，超聲提取15 min。提取物抽濾，蒸去丙酮，水層濃縮體積，用乙酸乙酯萃取2 次，收集上清液。固體殘渣再用乙酸乙酯浸提3 次，每次浸泡過夜，抽濾，收集上清液。將5 次得到的上清液合并，減壓旋轉蒸發，共得浸膏47.6 g。粗浸膏以1∶1 的比例與100～200 的硅膠H 拌勻，待干燥后填入中壓正相硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脫，TLC 薄層檢測后合并，得到8 個餾分Fra.1～8。Frs.4 經重結晶得到化合物1 (200 mg);Frs.5 經液相制備(CH3OH∶H2O=6∶4)得到化合物2(25 mg);Fra.7 經Sephadex LH-20 凝膠柱(甲醇)分離，得到5 個餾分Fra.7a～Frs.7e，其中Fra.7c 經正相硅膠柱分離，二氯甲烷-甲醇(1∶0～0∶1)洗脫，得到8 個餾分Fra.7c1～Fra.7c8。Fra.7c3 重結晶得到化合物3(27 mg)。Fra.7c5 經正相硅膠柱分離，二氯甲烷-甲醇(1 ∶0～0 ∶1)，得到化合物4(3 mg)、5(15 mg)。Fra.7d 經ODS 柱分離，甲醇-水(1∶9，1 ∶1，7 ∶3，9 ∶1)得到4 個餾分Fra.7d1～ Fra.7d4。Fra.7d3 經液相制備(CH3OH∶H2O=6∶4)得到化合物6(5.3 mg)、7(4.7 mg)、8(10 mg)、9(20 mg)。

4 結構鑒定

化合物1 白色針狀結晶(CH3OH)，254 nm 處有紫外吸收。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δH:5.59(1H，brm，H-6)，5.39 (1H，brm，H-7)，5.22 (2H，m，H-22，23)，3.67 (1H，m，H-3)，1.04 (3H，d，J=6.5 Hz，H3-21)，0.97 (3H，s，H3-10)，0.93 (3H，d，J=6.5 Hz，H3-28)，0.83 (6H，t，J=7.5 Hz，H3-26，H3-27)，0.65 (3H，s，H3-18);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δc::141.4 (C，C-8)，139.8 (C，C-5)，135.6(CH，C-21)，132.0 (CH，C-22)，119.6 (CH，C-6)，116.3 (CH，C-7)，70.5 (CH，C-3)，55.8 (CH，C-17)，54.6 (CH，C-14)，46.3 (CH，C-9)，42.8 (CH，C-13)，40.8 (CH2，C-4)，40.4 (CH，C-24)，39.1(CH2，C-12)，38.4 (CH2，C-1)，37.1 (C，C-10)，33.1 (CH，C-25)，32.0 (CH2，C-2)，28.3 (CH2，C-16)，23.0 (CH2，C-15)，21.1 (CH3，C-21)，19.9(CH3，C-26)，19.6 (CH3，C-27)，17.6 (CH3，C-28)，16.3 (CH3，C-19)，12.1 (CH3，C-18)。以上數據與文獻［5］對照，基本一致，確定化合物結構為ergosterol。

化合物2 淡黃色油狀物，254 nm 處有紫外吸收。EI-MS:112［M］+;1H NMR (500 MHz，CD3OD)δH:5.73 (1H，m，H-3)，4.34 (2H，t，J=10 Hz，H2-6)，2.41 (2H，t，J=5 Hz，H2-5)，1.99 (3H，brs，H3-7);13C NMR (CD3OD，125 MHz)δC:167.33 (C=O，C-2)，162.10 (C，C-4)，116.63 (CH，C-3)，67.63(CH2，C-6)，30.32 (CH2，C-5)，23.11 (CH3，C-7)。以上數據與文獻［6］對照，基本一致，確定化合物結構為4-methyl-5，6-dihydro-2-pyranone。

化合物3 白色晶體，EI-MS:500 ［M］+，高分辨給出分子式為C28H36O8;1H NMR (500 MHz，DMSO)δH:5.24 (1H，s，H-11)，4.77 (1H，d，J=4.5 Hz，H-6)，4.48 (1H，brs，H-3)，3.89 (1H，d，J=14.3，4.5 Hz，H-7β)，3.40 (3H，s，H3-28)，2.48(1H，m，H-9)，2.33 (1H，dd，J=14.3，4.5 Hz，H-7α)，1.99 (3H，s，H3-27)，1.90 (1H，brs，H-1)，1.88 (1H，brs，H-5)，1.74 (3H，s，H3-21)，1.57(1H，m，H-2)，1.28 (3H，s，H3-18)，1.12 (3H，s，H3-22)，1.02 (3H，s，H3-20)，0.89 (3H，s，H3-24)，0.78 (3H，s，H3-25);13C NMR (DMSO，125 MHz)δc:194.3 (C，C-15)，194.1 (C，C-17)，179.2 (C，C-23)，173.2 (C=O，C-19)，169.6 (C=O，C-26)，140.3 (C，C-12)，118.4 (CH，C-11)，103.5 (C，C-16)，77.9 (CH，C-6)，75.5 (CH，C-3)，70.0 (C，C-14)，54.8 (C，C-13)，53.8 (CH，C-5)，50.6 (CH，C-9)，50.2 (CH3，C-28)，43.2 (C，C-10)，41.1 (C，C-8)，36.4 (CH2，C-7)，33.8 (C，C-4)，25.8 (C，C-24)，24.2 (CH3，C-22)，22.0 (C，C-25)，21.7 (CH，C-2)，20.9 (CH3，C-21)，20.7 (CH3，C-27)，20.6(CH，C-1)，17.7 (CH3，C-20)，7.9 (CH3，C-18)。以上數據與文獻［7］對照，基本一致，確定化合物結構為citreohybridonol。

化合物4 白色晶體，EI-MS:428 ［M］+;1H NMR (500 MHz，CDCl3)δH:5.27 (2H，m，H-22，H-23)，4.88 (1H，brd，J=6.6 Hz，H-7α)，4.31 (1H，m，H-3α)，3.37 (1H，d，J=2.5 Hz，H-6β)，2.55(1H，dd，J=13.2，11.7 Hz，H-4β)，1.28 (3H，s，H3-19)，1.07 (3H，d，J=6.6 Hz，H3-21)，0.96 (3H，s，H3-18)，0.94 (3H，d，J=6.9 Hz，H3-28)，0.85 (6H，d，J=6，8 Hz，H3-26，H3-27);13C NMR (150 MHz，CDCl3)δc:151.6 (C-14)，135.2 (C-22)，132.4(C-23)，126.8 (C-8)，68.7 (C-3)，64.9 (C-5)，63.6(C-7)，60.3 (C-6)，55.4 (C-17)，43.7(C-13)，42.9(C-24)，40.5 (C-20)，39.3 (C-9)，39.2 (C-4)，37.1 (C-12)，34.9 (C-10)，33.1 (C-25)，33.0 (C-1)，31.2 (C-2)，28.0 (C-16)，25.9 (C-15)，21.1(C-21)，20.0 (C-27)，19.7 (C-26)，19.3 (C-11)，17.9 (C-28)，17.7 (C-28)，16.9 (C-19)。以上數據與文獻［8］對照，基本一致，確定化合物結構為5α，6α-Epoxy-(22E，24R)-ergosta-8(14)，22-diene--3β，7β-diol。

化合物5 無色油狀物，EI-MS:354 ［M］+;1H NMR (500 MHz，CDCl3)δH:5.36 (4H，m，H-9，10，12，13)，4.20 (1H，dd，J=11.5，4.5 Hz，Ha-19)，4.16 (1H，dd，J=11.5，6 Hz，Hb-19)，3.93 (1H，m，H-20)，3.70 (1H，dd，J=11.5，4.5 Hz，H-21a)，3.60 (1H，dd，J=11.5，4.5 Hz，H-21b)，2.77 (2H，t，J=6.5 Hz，H2-11)，2.35 (2H，t，J=7.5 Hz，H2-2)，2.05 (4H，m，H2-8，H2-14)，1.64 (2H，m，H2-3)，1.25～1.40 (14H，m)，0.89 (3H，t，J=6.5 Hz，H3-18);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δC:174.3 (C=O，C-1)，130.2 (CH，C-9)，130.0 (CH，C-13)，128.1(CH，C-10)，127.9 (CH，C-9)，70.3 (CH，C-20)，65.2 (CH2，C-19)，63.3 (CH，C-21)，34.1 (CH2，C-2)，31.5 (CH2，C-16)，29.6 (CH2，C-7)，29.3(CH2，C-6)，29.1 (CH2，C-17)，29.1 (CH2，C-5)，29.1 (CH2，C-4)，27.2 (CH2，C-8)，27.2 (CH2，C-14)，25.6 (CH2，C-11)，24.9 (CH2，C-3)，22.6(CH2，C-17)，14.1 (CH3，C-18)。以上數據與文獻［9］對照，基本一致，確定化合物結構為1-Linoleoylglycerol。

化合物6 白色固體，EI-MS:360 ［M］+;1H NMR (500 MHz，CD3OD)δH:5.91 (1H，d，J=1.6，H-2')，4.77 (1H，brs，Ha-12)，4.52 (2H，brs，Hb-12 and H-4')，4.29 (1H，d，J=17.7 Hz，H-7'a)，4.21(1H，d，J=17.7 Hz，H-7'b)，3.67 (1H，d，J=2.9 Hz，H-5')，2.33 (1H，ddd，J=12.6，3.9，2.5 Hz，H-7e)，2.31 (1H，d，J=14.0 Hz，H-11a)，1.92 (1H，td，J=12.6，3.9 Hz，H-7a)，1.81 (1H，dd，J=14.0，11.1 Hz，Hb-11)，1.76 (1H，dt，J=12.6，3.9 Hz，H-1e)，1.75 (1H，d，J=11.1 Hz，H-9)，1.72 (1H，m，H-6e)，1.60 (1H，qt，J=13.6，3.4 Hz，H-2a)，1.49(1H，dquint，J=13.6，3.4 Hz，H-2e)，1.38 (1H，dm，J=13.6 Hz，H-3e)，1.30 (1H，qd，J=12.6，3.9 Hz，H-6a)，1.21 (1H，td，J=13.6，4.6 Hz，H-3a)，1.18 (1H，td，J=13.6，3.4 Hz，H-1a)，1.12 (1H，dd，J=12.6，2.5 Hz，H-5)，0.70 (3H，s，H3-13)，0.79 (3H，s，H3-14)，0.85 (3H，s，H3-15);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δC:195.4 (C=O，C-1')，161.2(C，C-3')，150.5 (C，C-8)，120.2 (CH，C-2')，107.4 (CH2，C-12)，64.3 (CH，C-4')，64.0 (CH2，C-7')，62.2 (CH，C-5')，59.5 (C，C-6')，55.7 (CH，C-5)，51.5 (CH，C-9)，43.3 (CH2，C-3)，40.7 (C，C-10)，40.0 (CH2，C-1)，39.3 (CH2，C-7)，34.5(C，C-4)，34.1 (CH3，C-13)，25.6 (CH2，C-6)，22.2(CH3，C-14)，22.0 (CH2，C-11)，20.4 (CH2，C-2)，15.0 (CH3，C-15)。以上數據與文獻［10］對照，基本一致，確定化合物結構為Macrophorin。

化合物7 無定型粉末，EI-MS:418 ［M］+;1H NMR (500 MHz，CD3OD)，δH:6.12 (2H，brs，H2-2')，4.90 (1H，brs，H-12a)，4.79 (1H，brs，H-12b)，4.41 (2H，brs，H-7')，3.96 (1H，s，H-5')，3.05(1H，d，J=17.2 Hz，H-8'e)，2.91 (1H，d，J=17.2 Hz，H-8')，2.36 (1H，ddd，J=12.9，3.9，2.5 Hz，H-7b)，2.20 (1H，dd，J=14.8，4.6 Hz，H-11a)，2.11 (1H，td，J=12.9，4.8 Hz，H-7a)，1.97 (1H，m，H-11b)，1.82 (1H，m，H-9)，1.73 (1H，brd，J=12.9 Hz，H-6b)，1.72 (1H，brd，J=13.7 Hz，H-1b)，1.58 (1H，qt，J=13.7，3.4 Hz，H-2a)，1.45 (1H，qt，J=13.7，3.4 Hz，H-2b)，1.36 (1H，td，J=13.7，3.4 Hz，H-3b)，1.31 (1H，qd，J=12.9，3.9 Hz，H-6a)，1.17 (1H，dd，J=12.5，2.5 Hz，H-5)，1.14 (1H，td，J=13.7，3.4 Hz，H-3a)，1.12 (1H，td，J=13.7，3.4 Hz，H-1a)，0.84 (3H，s，H3-13)，0.78 (3H，s，H3-14)，0.70 (3H，s，H3-15);13C NMR (125 MHz，CD3OD)δc:192.3 (C=O，C-1')，167.8 (C=O，C-9')，164.5 (C，C-3')，150.1 (C，C-8)，120.4 (CH2，C-2')，108.0 (CH2，C-12)，85.2 (C，C-6')，74.7(CH，C-5')，71.8 (C，C-4')，60.7 (CH2，C-7')，56.2 (CH，C-5)，50.2 (C，C-9)，43.3 (CH2，C-8')，42.8 (CH2，C-3)，41.0 (C，C-10)，39.3 (CH2，C-1)，38.8 (CH2，C-7)，34.2 (C，C-4)，33.8 (CH3，C-13)，25.2 (CH2，C-6)，22.2 (CH2，C-11)，22.0(CH3，C-14)，19.9 (CH2，C-2)，15.1 (CH3，C-15)。以上數據與文獻［11］對照，基本一致，確定化合物結構為purpurogemutantin。

化合物8 黃色粉末，EI-MS:218 ［M］+;1H NMR (500 MHz，CD3OD)δH:6.37 (1H，s，H-4)，6.31 (2H，s，H-5，7)，4.22 (1H，m，H-2')，4.02(1H，m，H-4')，2.62 (1H，dd，J=14.4，4.9 Hz，Hb-1')，2.55 (1H，dd，J=14.4，8.Hz，Ha-1')，1.58(1H，ddd，J=14.2，8.2，7.2 Hz，Ha-3')，1.33(1H，ddd，J=14.2，4.9，3.9 Hz，Hb-3')，1.19 (3H，d，J=6.3 Hz，CH3-5');13C NMR (125 MHz，CD3OD)δC:167.9 (C=O，C-1)，167.3 (C，C-6)，164.9 (C，C-8)，156.2 (C，C-3)，141.3 (C，C-10)，107.2 (CH，C-4)，103.7 (CH，C-5)，102.7 (CH，C-7)，99.9 (C，C-9)，67.1 (CH，C-2')，65.3 (CH，C-4')，47.0 (CH2，C-3')，43.0 (CH2，C-1')，24.4(CH3，C-5')。以上數據與文獻［12］對照，基本一致，確定化合物結構為3-(2S，4S-dihydroxypentyl)-6，8-dihydroxyisocoumarin。

化合物 9 無色針狀結晶，EI-MS:280［M］+;1H NMR (500 MHz，CD3OD)δH:6.56 (1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.53 (1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，5.96 (1H，s，H-2)，4.10 (1H，m，H-2')，2.62(1H，dd，J=14.4，5.1 Hz，H-1')，2.62 (3H，s，H3-11)，2.55 (1H，dd，J=14.4，7.9 Hz，H-1')，1.18(1H，d，J=6.2 Hz，H-3');13C NMR (125 MHz，CD3OD)δC:182.11 (C，C-4)，167.2 (C，C-5)，163.1 (C，C-9)，161.6 (C，C-2)，143.8 (C，C-7)，118.1 (CH，C-3)，118.1 (C，C-3)，116.0 (C，C-10)，112.6 (CH，C-6)，101.8 (CH，C-8)，66.5(CH，C-2')，44.3 (CH2，C-1')，23.6 (CH3，C-11)，23.2 (CH3，C-3')。以上數據與文獻［13］對照，基本一致，確定化合物結構為 5-hydroxy-7-(2'-hydroxypropyl)-2-methyl-chromone。

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