黃芪多糖和葡萄籽提取物對衰老模型小鼠負重游泳時間和血常規參數的影響

徐海軍，陶文眾，彭歡歡，張 林，許玉寶，金 露

皖西學院生物與制藥工程學院健康養殖與動物疫病監測預警工程技術中心，六安 237012

隨著我國人民生活水平的提高和生活方式的改變，以及社會主流消費群體中“丁克族”、“單身貴族”的出現和老年獨居人群、獨生子女數量的增加，寵物產業迅速興起。寵物飼料是寵物飼養中的最大支出，占整體寵物市場的71%，具有很大的市場空間。中草藥植物提取物為純天然綠色產品，添加劑量小、適口性好、毒副作用小，能全面調整機體生理功能，符合當今時代發展潮流。隨著寵物養殖和寵物飼料工業的發展以及人們環保意識的不斷增強，中草藥植物提取物作為一種新型的寵物飼料添加劑受到越來越廣泛的重視和應用［1，2］。寵物隨著年齡的增長，也會出現與人類相似的衰老現象。寵物主人飼養寵物的時間越長，對寵物的感情往往也更深厚，更希望所飼養的寵物能盡可能長久地保持健康和活力。因此，開發具有抗衰老作用的寵物飼料將具有很好的市場前景。

黃芪多糖是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的水溶性雜多糖。黃芪多糖具有抗氧化、提高免疫力、增強體質、抗腫瘤、腸道保鍵、抗病毒、抗細菌、抗衰老和抗輻射等作用［3，4］。許多研究表明，在日糧中添加黃芪多糖，可以改善動物的生長性能和產品品質［5-7］。葡萄籽提取物是從釀酒葡萄籽中提取的一種多酚類物質的混合物，其主要活性成分是葡萄籽原花青素［8］。研究表明，葡萄籽原花青素具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗炎和免疫調節等多種功能［9-11］。有關在日糧中添加這兩種物質對衰老動物負重游泳時間和血常規參數的影響還鮮見研究。本研究比較了日糧中單獨添加或同時添加黃芪多糖和葡萄籽提取物對衰老模型小鼠負重游泳時間和血常規參數的影響，以期為將其開發成抗衰老寵物飼料添加劑提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

葡萄籽提取物(低聚體占64%，原花青素含量為98%，購自天津尖峰天然產物有限公司);黃芪多糖［純度:每1g 含黃芪多糖以葡萄糖計為571 mg，每1g 黃芪多糖粉相當于原生藥7 g，購自愛迪森(北京)生物科技有限公司］;D-半乳糖(Sigma);肝素鋰抗凝管(山東奧賽特醫療器械有限公司);HC 海邁血液測試系統(山東美醫林電子儀器有限公司)。

1.2 實驗動物、分組與飼養管理

健康昆明種雄性小鼠(體重23.5 ±2.35 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心，動物合格證號:皖醫實動準第01 號)40 只，適應性喂養一周，空腹稱重。隨機分為模型對照組、黃芪多糖處理組、葡萄籽提取物處理組、黃芪多糖+葡萄籽提取物處理組，每組10 只，分兩籠飼養，每籠5 只小鼠。模型對照組在小鼠標準飼料中添加0.5%半乳糖，黃芪多糖處理組、葡萄籽提取物處理組和黃芪多糖+葡萄籽提取物處理組飼料中除添加0.5%半乳糖外，還分別添加0.1%的黃芪多糖、0.1%葡萄籽提取物和0.1%的黃芪多糖+0.1%葡萄籽提取物。小鼠飼養在塑料飼養籠中，飼養籠底部墊有鋸末屑，頂部為鋼絲網蓋，配有自動飲水器，室溫(25 ±1)℃，相對濕度50±5%，自由飲水。

1.3 負重游泳時間測定

試驗第42 d 時，對各組小鼠稱重，根據體重進行負重游泳試驗，負重方法為在小鼠尾巴懸掛體重15%的重物。泳池采用水深40 cm，直徑30 cm 的塑料桶。水溫25 ℃左右。輕輕將小鼠放入泳池中時開始計時，在觀測過程中若有小鼠弓腰靜止懸浮休息，則用玻璃棒進行刺激，使之游動。當小鼠沉入水下10 s，不能浮出水面時終止計時。

1.4 血常規參數測定

負重游泳試驗結束后第2 d，即試驗第43 d 早上，空腹從眼眶采血，肝素鋰抗凝，用HC 海邁血液測試系統檢測各項血常規參數。

1.5 數據統計和分析

采用DPS 軟件對各項指標進行單因素方差分析，并用Duncan 氏法進行多重比較。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 實驗結果

各處理組小鼠負重游泳時間和血常規參數測定結果見表1。從表1 可見，與衰老模型組相比，同時添加黃芪多糖和葡萄籽提取物可提高小鼠的負重游泳時間(P＜0.05);單獨添加黃芪多糖或葡萄籽提取物對負重游泳時間影響不顯著(P ＞0.05)。

在血常規參數方面，與衰老模型組相比，同時添加黃芪多糖和葡萄籽提取物顯著降低小鼠的粒細胞數(P＜0.05)，極顯著降低小鼠紅細胞平均血紅蛋白含量(MCH)(P＜0.01);單獨添加黃芪多糖顯著降低紅細胞分布寬度(RDW)(P＜0.05)，極顯著降低血紅蛋白濃度(HGB)(P＜0.01)、MCH(P＜0.01)和紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)(P＜0.01);單獨添加葡萄籽提取物極顯著降低紅細胞平均體積(MCV)(P＜0.01)、RDW(P＜0.01)和MCH(P＜0.01)。

3 討論

目前常用一些動物模型來研究人類衰老。這些模型中，D-半乳糖致衰老模型造模時間短、操作簡便、模型易于建成、重復性好，表現出與自然衰老動物相似的衰老體征，已成為國內較公認的衰老動物模型［12］。D-半乳糖致衰老模型的原理是在一定時間內，連續給動物注射大劑量D-半乳糖，使機體細胞內半乳糖濃度增高，在醛糖還原酶的催化下，生成半乳糖醇，這種物質不能被細胞進一步代謝，而堆積在細胞內，影響正常滲透壓，使細胞腫脹，引起機體多器官、多系統的功能障礙，最終導致衰老的發生［13］。該模型在整體水平上與自然衰老比較相似，因此被廣泛用于腦老化、白內障、篩選藥物以及評價具有延緩衰老的保健品等方面的研究［14-16］。但由于D-半乳糖致衰老效應需時較長，長期重復注射給藥有諸多不利，如易引起感染、藥物吸收不良、動物體重下降及其他不良反應，致使模型研究不能獲得預期效果。因此，李春海等(2008)［17］以口服途徑對D-半乳糖的致衰老效應進行了探討，發現與皮下注射給藥途徑相比，口服途徑具有效果相近、體重減低不明顯、簡便易行、節約人力物力等優點。李春海等(2008)［17］研究結果表明，每日口服700 mg/kgD-半乳糖，連續6 周，即可獲得較好的擬衰老效應。本研究預試驗采用皮下連續注射D-半乳糖制作衰老模型，結果部分小鼠出現注射部位膠凍樣腫脹，個別小鼠發生死亡。所以，本研究正式試驗采用在小鼠飼料中添加D-半乳糖制作衰老模型。參考文獻D-半乳糖使用劑量(李春海等，2008)［17］，結合小鼠每天的采食量，確定日糧中D-半乳糖的添加比例為0.5%。

表1 黃芪多糖和葡萄籽提取物對衰老模型小鼠負重游泳時間和血常規參數的影響(n=10，)Table 1 Effect of astragalus polysaccharides and grape seed extract on the loaded swimming time and blood parameters in aged mice model (n=10，)

表1 黃芪多糖和葡萄籽提取物對衰老模型小鼠負重游泳時間和血常規參數的影響(n=10，)Table 1 Effect of astragalus polysaccharides and grape seed extract on the loaded swimming time and blood parameters in aged mice model (n=10，)

注:同行數據標注不同小寫字母表示有顯著性差異(P＜0.05)，標注不同大寫字母表示有極顯著差異(P＜0.01);表中數據每組樣本個數為10(n=10)。Note:The data within same row with different lowercase letters and capital letters indicated significant (P＜0.05)and very significant (P＜0.01)differences;Each result was the mean of 10 samples.

負重游泳試驗是評價小鼠抗疲勞能力的常用試驗。一般采用的負重量是體重的10%［16］。但本研究發現負重量為體重的10%時，有較多小鼠可在水中呈靜止懸浮狀態。當負重為體重的20%時，小鼠馬上直接沉入水中。當負重為體重的15%時，小鼠基本上不能在水中懸浮靜止，也不會馬上直接沉入水中，而會拼命游泳以保持鼻孔不沒入水中。所以本研究采用15%體重的負重量進行實驗。從實驗結果來看，單獨添加黃芪多糖或葡萄籽提取物對小鼠的負重游泳時間沒有顯著影響(P ＞0.05)，而同時添加黃芪多糖和葡萄籽提取物可以顯著延長小鼠的負重游泳時間(P＜0.05)。衰老的一個明顯生理特點是抗疲勞能力降低。所以抗衰老的藥品或保健品理論上能提高衰老模型小鼠的負重游泳時間。本研究未發現黃芪多糖或葡萄籽提取物單獨應用時有顯著抗疲勞作用，其原因還有待進一步探討。可能與黃芪多糖和葡萄籽提取物使用的劑量和添加方式有關。但本研究發現黃芪多糖和葡萄籽提取物同時添加時能顯著延長小鼠的負重游泳時間，說明兩者存在較好的協同作用，兩者的最佳劑量組合有待于進一步研究。

本研究觀察了黃芪多糖、葡萄籽提取物單獨添加或同時添加時對衰老模型小鼠血常規參數的影響，發現同時添加黃芪多糖和葡萄籽提取物顯著降低小鼠的粒細胞數(P＜0.05)，并且黃芪多糖和葡萄籽提取物單獨添加或同時添加還對衰老模型小鼠的紅細胞相關指標產生一定影響。MCV、MCH 和MCHC 是根據紅細胞計數、血紅蛋白測定和紅細胞比積結果計算出來的，對貧血的鑒別有一定的價值。本研究中，同時添加黃芪多糖和葡萄籽提取物極顯著降低小鼠MCHC(P＜0.01)，對MCH 也有降低的趨勢。值得注意的是，HGB、MCHC 和MCH 反映機體紅細胞的攜氧能力，這些指標升高似乎有利于提高機體血液的攜氧能力，從而延長小鼠負重游泳時間。在一些非衰老動物模型實驗中，肌注［18］或口服［19，20］黃芪多糖能提高動物血液的血紅蛋白水平，口服葡萄籽提取物也提高動物血液中血紅蛋白水平［21］。但本研究結果發現，黃芪多糖或葡萄籽提取物單獨添加或同時添加時均程度不一地降低這些指標的水平。晏瑞琴等(2006)［22］報道高原短跑運動員不同負荷前后血紅蛋白和白細胞數均會出現升高的變化，該研究在運動后即刻進行采血測定。本研究中，血常規參數檢測是在負重游泳試驗后的第2 d進行的，因此本研究中粒細胞數和紅細胞相關指標的變化是否受到負重游泳試驗的影響還有待進一步研究。如果受到影響，則黃芪多糖和葡萄籽提取物單獨添加或同時添加或許可以減輕負重游泳對這些指標的影響，降低它們的升高幅度。這些推測還有待進一步研究證實。

4 結論

在本研究實驗條件下，單獨添加黃芪多糖或葡萄籽提取物對衰老模型小鼠的負重游泳時間影響不明顯，而同時添加黃芪多糖和葡萄籽提取物可顯著延長衰老模型小鼠的負重游泳時間，說明兩者同時添加可獲得較好的協同作用。單獨或同時添加黃芪多糖和葡萄籽提取物對衰老模型小鼠部分血常規參數(特別是紅細胞相關指標)有一定影響。

1 Leimolei B (B·勒莫雷)，Dalimoter-Nikelao C (C·達里莫特-尼科勞).Pet food composition for regulating body weight and preventing obesity and related disorders in pets(用于調節體重和防止肥胖及相關障礙的寵物飼料組合物).CN 02814453，2011-7-13.

2 Chen JS (陳金生).A pet food composition for health care and its preparation method (一種寵物保健的組合物及其制備方法).CN 200510110758，2009-2-11.

3 Shen YJ(申義君)，Zhou JW(周金偉)，Wang B(王斌)，et al.Effects of Astragalus polysaccharides on the activity of antioxidant enzyme in lactating holstein cows.Nat Prod Res Dev (天然產物研究與開發)，2014，26:244-247.

4 Jin LY(金連玉).Progress of chemical and pharmacological study of Astragalus polysaccharide.Heilongjiang Sci Technol Inf (黑龍江科技信息)，2013，21:2.

5 Li SP(李樹鵬)，Zhao XJ(趙獻軍).Effects of synbiotics of Astragalus polysaccharide and profitable microbe on growth performance and immune function of chick.Chin Agric Sci Bull(中國農學通報)，2005，21(6):51-54.

6 Xiang X(向梟)，Chen J(陳健)，Zhou XH(周興華)，et al.Effect of Astragalus polysaccharides on growth，body composition and immune index in Schizothorax Prenanti.Acta Hydrobiol Sin (水生生物學報)，2011，35:291-299.

7 Wang CJ(王翠菊)，Wang HF(王洪芳)，Chen H(陳輝)，et al.Effects of Astragalus polysaccharides on antioxidant capacity and egg quality of laying hens.Chin J Anim Nutri (動物營養學報)，2011，23:280-284.

8 Shi J，Yu J，Pohorly JE，et al.Polyphenolics in grape seedsbiochemistry and functionality.J Med Food，2003，6:291-299.

9 Li RF(李潤豐).Proanthocyanidins in grape seeds.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2002，14(6):88-91.

10 Wang Y(王穎)，Zhang GF(張桂芳)，Xu BZ(徐炳政)，et al.Effect of grape seed proanthocyanidin extracts on blood glucose of diabetic mice.Nat Prod Res Dev (天然產物研究與開發)，2012，24:1191-1195.

11 Zhao J (趙嬌).Effects and possible mechanism of grape seed procyanidins on alleviating hepatic oxidative damage in weaned piglets.Yaan:Sichun agricultural University (四川農業大學)，MSc.2013.

12 Lei M (雷鳴)，Zhu ZJ (朱祖健).The research progress of D-galactose-induced aging.Prog Anatomical Sci (解剖科學進展)，2011，17:83-85.

13 Xu Y (許揚)，Wu T (吳濤)，Gu JL (顧佳黎).The research progress of D-galactose-induced aging animal model.Chin J Gerontol(中國老年學雜志)，2009，29:1710-1713.

14 Luan HY (欒海云)，Wang GH (王桂華)，Xu Y (許勇)，et al.Antioxidant effects of tricholoma matsutake extracting solution on aging mice induced by D-galactose.J Anhui Agric Sci(安徽農業科學)，2012，40:8471-8472.

15 Fu YJ (傅永錦)，Pan JQ (潘競鏘)，Zhang XM (張小牧)，et al.Effects of silybin on inhibiting glycoxidative stress and improving the learning and memory in aging rats treated by D-galactose.Chin J Clin Pharm Ther (中國臨床藥理學與治療學)，2012，17:10-14.

16 Wang LM (王麗梅)，Ye C (葉誠)，Wu C (吳晨)，et al.The effect ofperilla oil on anti-aging for aging model rats.Food Sci Tech (食品科技)，2013，38:280-284.

17 Li CH (李春海)，Liu YQ (劉亞千)，Chen H (陳華).Evaluation of method of developing senescence by oral administration of D-galactose.Lab Anim Sci (實驗動物科學)，2008，25(3):5-7，17.

18 Xiang JZ (向建洲)，Li WP (李文平)，Peng T (彭濤)，et al.Effect of Astragalus polysaccharides on blood index of rats.Hunan J Anim Sci Vet Med (湖南畜牧獸醫)，2008，(6):10-11.

19 Zhang YQ (張艷秋).Studies on anti-fatigue effect of Astragalus polysaacharide and its mechanism.Yanbian:Yanbian University (延邊大學)，MSc.2009.

20 Zhang F (張飛)，Xu JB (許靜波)，Mou T (牟藤)，et al.Effects of astragalus polysaacharide on blood physiological parameters and growth performance in weaned piglets.Feed Ind (飼料工業)，2011，32(13):16-18.

21 Liu X (劉協)，Li XN (李小寧)，Bao LX (包六行)，et al.Effect of grape seed extract proanthocyanidin on loaded swimming time in mice.Chin J Clin Rehabilitation (中國臨床康復)，2005，9:245-247.

22 Yan RQ (晏瑞琴)，Yuan JX (袁際學)，Kang L(康連)，et al.Changes of hemoglobin and leucocyte after different loads of sprinter in plateau.J Qujing Normal Univ (曲靖師范學院學報)，2006，25(6):89-91.