黃芪多糖對免疫抑制模型小鼠Treg 細胞及Th17 細胞亞群的影響

王雪梅，賈天玉，管 彬，馮燕海，雒艷萍，曹明強，于紅娟，馬興銘，3*

1蘭州大學口腔醫學院;2 蘭州大學基礎醫學院;3 甘肅省循證醫學與臨床轉化重點實驗室，蘭州 730000

多糖是指由10個以上單糖分子鏈接成的碳水化合物，天然活性多糖是一種良好的免疫增強劑，能夠顯著提高機體的特異性或非特異性免疫［1］。黃芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)作為中藥黃芪中重要的天然有效活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗應激、抗氧化、增強免疫功能等的免疫調節效應［2-4］。近年發現一種主要分泌IL-17 的特殊CD4+Th 細胞亞群，即Th17 細胞亞群，降低或阻斷Th17細胞的活性可緩解炎癥反應的發生和發展［5］。CD4+CD25+調節性T 細胞(Treg)是一類發揮免疫抑制功能的T 細胞，能夠有效抑制和調節機體效應淋巴細胞的增殖、活化［5］。我們的前期實驗研究發現黃芪多糖藥物能夠促進口腔粘膜上皮的再生與增殖，減小口腔潰瘍面積、減少黏膜組織的淋巴細胞浸潤，具有緩解口腔黏膜的炎癥反應的活性［3］，降低哮喘模型大鼠支氣管中的淋巴細胞、嗜酸性粒細胞以及巨噬細胞數量，減輕支氣管及肺泡的炎癥反應［4］，緩解炎癥反應的機制尚不清楚。因此，本實驗建立免疫抑制小鼠模型，用流式細胞儀分析小鼠脾臟中CD4+T 細胞、CD4+CD25+Treg 細胞的比例，ELISA 檢測小鼠血清IL-17 的含量，首次研究黃芪多糖對免疫抑制模型CD4+CD25+Treg 細胞亞群及Th17 細胞活化的影響，進一步揭示黃芪多糖緩解炎癥反應的免疫調節機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

清潔級昆明種雌性小鼠50 只，體重(20 ±2)g，由蘭州大學實驗動物中心提供(合格證號:醫動字第14-005 號)，飼養環境溫度22 ±1 ℃，自由進食、飲水。黃芪多糖購陜西創升生物科技有限公司(多糖含量40%)。抗鼠CD4-FITC(eBioscience)、抗鼠CD25-APC(eBioscience)、IL-17 ELISA 試劑盒、淋巴細胞分離液購自達科為生物工程有限公司。RPMI-1640 培養基為Gibco 產品。環磷酰胺注射液由山西普德藥業股份有限公司(批號:04130901)。

1.2 動物模型的建立與給藥

小鼠隨機分為模型對照組、黃芪多糖高、中、低劑量組和空白對照組，每組10 只。模型對照組和黃芪多糖藥物組小鼠于第1 d、第2 d、第3 d、第10 d腹腔注射環磷酰胺80 mg/(kg·d)，建立免疫抑制模型［6］。模型對照組于建模第4 d 灌服生理鹽水0.2 mL/20g·d;黃芪多糖藥物組于建模第4 d 灌服不同劑量黃芪多糖，藥物劑量分別為1.0 g/(kg·d)(高劑量組)、0.5 g/(kg·d)(中劑量組)、0.25 g/(kg·d)(低劑量組);空白對照組在相同時間點分別注射和灌服等體積生理鹽水，連續給藥10 d。次日眼球后采血，分離血清并經56 ℃30 min 滅活，-20 ℃保存備用。分離胸腺和脾臟并稱量濕重，分別計算胸腺或脾臟指數，同時制備脾淋巴細胞懸液。

1.3 淋巴細胞懸液制備與流式細胞儀檢測

無菌取脾，剪碎研磨，加入適量不完全1640 培養液，過200 目尼龍網，制備脾細胞懸液，用淋巴細胞分離液(2000 rpm 離心40 min)密度梯度離心法，分離脾臟淋巴細胞，PBS 緩沖液洗滌細胞一次，調整淋巴細胞懸液濃度為1 ×107個/mL。取淋巴細胞懸液100 μL，按照試劑盒說明分別加入熒光素標記的FITC-CD4 與APC-CD25 單克隆抗體，避光4 ℃孵育30 min，加入預冷PBS 1 mL 重懸細胞，2400 rpm離心5 min，棄上清，細胞沉淀重懸于500 μL 緩沖液，經400 目尼龍網過濾細胞后上機，BD LSRFortessa 型流式細胞儀(美國BD 公司)檢測并分析小鼠脾臟CD4+T 細胞/淋巴細胞、CD4+CD25+Treg 細胞/淋巴細胞、CD4+CD25+Treg 細胞/CD4+T 細胞的百分比。

1.4 血清IL-17 含量檢測

酶聯免疫吸附法(ELISA)測定各組小鼠血清IL-17 含量，操作按說明書進行。

1.5 統計學方法

實驗數據用SPSS17.0 軟件的One-Way 方差分析(ANOVA)，以平均值±標準差即±SD 表示，最小顯著差(LSD)進行統計處理。

2 實驗結果

2.1 黃芪多糖對小鼠免疫器官質量的影響

各組小鼠的胸腺指數和脾臟指數變化無統計學差異，表明0.25～1.0 mg/(kg·d)劑量范圍的黃芪多糖對免疫抑制小鼠的胸腺和脾臟質量無明顯影響。

2.2 黃芪多糖對小鼠CD4+ T 細胞、CD4+ CD25+Treg 細胞亞群比例的影響

流式細胞分析儀檢測免疫抑制模型小鼠脾臟CD4+T 細胞/淋巴細胞、CD4+CD25+Treg 細胞/淋巴細胞及CD4+CD25+Treg 細胞/CD4+T 細胞的百分比的結果見圖1～3。與空白對照組比較，免疫抑制各組小鼠CD4+T 細胞數占淋巴細胞數的比例均顯著降低(P＜0.05);與模型對照組比較，黃芪多糖高、中劑量組小鼠CD4+T 細胞數的比例明顯降低，具有顯著性差異(P＜0.05)(圖1 左)。模型對照組CD4+CD25+Treg 細胞占淋巴細胞數的比例升高，與空白對照組比較無統計學意義(P ＞0.05)，但經黃芪多糖藥物作用后，高、中劑量組小鼠CD4+CD25+Treg 細胞數的比例降低(P＜0.05)(圖1 右)。模型對照組CD4+CD25+Treg 細胞占CD4+T 細胞數的比例顯著升高，與空白對照組比較有統計學意義(P＜0.05)，經黃芪多糖藥物作用后，小鼠脾臟CD4+CD25+Treg 細胞的比例均升高，尤其以高、中劑量組升高最明顯(圖2、圖3)。表明黃芪多糖未顯示出拮抗環磷酰胺誘導的Treg 細胞上升，而與環磷酰胺協同上調小鼠脾臟CD4+CD25+Treg 細胞數/CD4 +T 細胞數的比例，降低CD4+T 細胞的比例，提示黃芪多糖具有提高小鼠脾臟Treg 細胞數而下調免疫功能的活性。

圖1 CD4 +T 細胞、CD4 + CD25 +Treg 細胞占淋巴細胞的比例(* P＜0.05，＊＊P＜0.01)Fig.1 The proportion of CD4 +T cells or CD4 + CD25 +Treg cells among lymphocytes (* P＜0.05，＊＊P＜0.01)

圖2 CD4 + CD25 +Treg 細胞占CD4 +T 細胞的比例(* P＜0.05)Fig.2 The proportion of CD4 + CD25 +Treg cells among CD4 +T cells (* P＜0.05)

2.3 黃芪多糖對小鼠血清IL-17 水平的影響

黃芪多糖對免疫抑制模型小鼠血清IL-17 水平的影響見圖4。模型對照組小鼠血清IL-17 的含量明顯升高，與空白對照組比較有統計學意義(P＜0.01)，經過黃芪多糖藥物作用后，黃芪多糖各劑量組小鼠血清IL-17 的含量均降低，尤其高、中劑量組小鼠血清IL-17 的含量降低顯著(P＜0.01，P＜0.05)(圖4)。表明黃芪多糖能夠拮抗環磷酰胺促小鼠分泌IL-17 的作用，對小鼠的Th17 細胞的功能具有下調作用，抑制其分泌IL-17。

3 討論

CD4+T 細胞在適應性免疫應答、炎癥反應中發揮重要作用，根據其生物學功能和產生細胞因子的不同，主要包括Th1 細胞亞群、Th2 細胞亞群、Th17細胞亞群和CD4+CD25+Treg 細胞亞群［5，7，8］。既往認為Th1/Th2 細胞亞群功能失調，會引起嚴重的炎癥反應并誘導產生多種自身免疫病。自從2005 年Th17 細胞作為一個新的CD4+T 細胞亞群被確認之后，發現Th17 細胞介導炎性反應、參與多種自身免疫病、移植排斥等的發生和發展，Th17 細胞主要的效應分子是其分泌IL-17，IL-17 能有效地介導中性粒細胞動員、募集活化過程，促進炎癥反應，通過抑制CD4+Th17 細胞活化或拮抗IL-17，可有效緩解炎癥反應的發生和發展［5，9］。CD4+CD25+Treg 細胞是一類在維持免疫耐受和免疫應答的負調節中發揮作用，能夠抑制和調節機體CD4+效應Th 細胞的增殖、活化［5，8］，已有多項研究將Treg 細胞用于自身免疫性病、超敏反應性疾病的治療，并取得了良好的結果，通過上調體內Treg 細胞的數量，從而抑制機體T細胞活化，可有效緩解炎癥損傷［10］。本實驗研究發現黃芪多糖具有提高脾臟Treg 細胞數，抑制CD4+Th17 細胞活化，降低血清IL-17 的水平，是其有效緩解炎癥損傷的機制之一。

圖3 流式細胞儀檢測小鼠脾臟CD4 +T 細胞、CD4 +CD25 +Treg 細胞百分比Fig.3 Flow cytometric examination of CD4 +T cells and CD4 + CD25 +Treg cells proportion

黃芪是一味藥用歷史悠久、臨床應用廣泛的傳統補益類中藥。黃芪多糖是從中藥黃芪中分離提純的主要天然有效活性成分，具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、抗應激、抗氧化等多種活性［1］。黃芪多糖作為一種免疫調節劑，能明顯升高大鼠淋巴細胞活性，促進IL-1、IL-2、TNF-α 等細胞因子的分泌及抗體的產生，從而發揮顯著增強免疫作用［11］。另一方面，研究發現黃芪多糖藥物能夠促進口腔黏膜上皮細胞增殖，減少黏膜組織的淋巴細胞浸潤，緩解口腔黏膜的炎癥損傷，促進潰瘍愈合［3］;黃芪多糖具有降低哮喘模型大鼠支氣管中的淋巴細胞、嗜酸性粒細胞以及巨噬細胞數量，減輕支氣管及肺泡的炎癥，可用于治療哮喘［4］;黃芪多糖能夠降低1 型糖尿模型小鼠胰島組織中炎癥細胞的浸潤，使其炎性細胞因子IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α 和INF-γ 的表達水平明顯下調，用于預防1 型糖尿病的發生［12］。表明黃芪多糖具有雙向的調節作用，對口腔潰瘍、哮喘、糖尿病等炎癥損傷具有緩解作用，減少炎癥組織的淋巴細胞浸潤。本實驗利用免疫抑制劑環磷酰胺建立免疫抑制模型小鼠，用黃芪多糖連續灌胃干預10天后，黃芪多糖未顯示出拮抗環磷酰胺誘導的Treg細胞上升［13］，而與環磷酰胺發揮協同效應，明顯上調小鼠脾臟CD4+CD25+Treg 細胞數/CD4+T 細胞數的比例，尤其以高、中劑量組升高最明顯。CD4+CD25+Treg 細胞比例的升高，有效抑制機體效應淋巴細胞的增殖、活化，導致CD4+T 細胞的比例的降低，抑制小鼠的Th17 細胞的活化，對抗環磷酰胺促進小鼠分泌IL-17 的作用，從而抑制Th17 細胞分泌IL-17。因此，黃芪多糖具有提高脾臟Treg 細胞數、抑制Th17 細胞活化的作用，可作為一種潛在的用于治療和預防炎癥損傷性疾病的中藥調節劑，但其上調節CD4+CD25+Treg 細胞數和抑制Th17 細胞活化的分子機制仍需進一步研究。

圖4 小鼠血清IL-17 含量(* P＜0.05，＊＊P＜0.01)Fig.4 The serum IL-17 levels in immunesuppressed mice(* P＜0.05，＊＊P＜0.01)

1 He WJ (何文涓)，Yuan ZJ (袁志堅)，He XS (何曉升).Research progress on pharmacological effects of Astraglus polysaccharide.Chin J Biochem Pharm (中國生化藥物雜志)，2012，33:692-694.

2 Dou H (竇輝)，Fu TJ (付鐵軍)，Zhang F (張帆)，et al.Chemical constituents of Huangqi injection.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2002，14:14-17.

3 Wang XM(王雪梅)，Bo L (薄磊)，Qi J (祁晶)，et al.Therapeutic effects of astragalus polysaccharides on oral ulcers in rats.Nat Prod Res Dev (天然產物研究與開發)，2013，25:321-324.

4 Li CD (李承德)，Zhou WB (周文賓)，Sun Y (孫艷)，et al.Effects of astragalus polysaccharide on Thl7/Treg associated cytokines and airway inflammation in OVA-induced asthmatic rats.Chin Pharm Bull (中國藥理學通報)，2013，29:1275-1279.

5 Xin CH，Joost J.Oppenheim.Th17 cells and Tregs:unlikely allies.J Leukocyte Biol，2014，95:723-731.

6 Tian WH (田衛花)，Ma XM (馬興銘)，Liu Y (劉英)，et al.Effects of aqueous extracts from Sophora moorcroftiana on cellular immunological functions in the immunosuppressive mice.Nat Prod Res Dev (天然產物研究與開發)，2009，21:472-479.

7 He Y (何英)，Zheng CQ (鄭長青)，Lin Y (林艷)，et al.Research on Th17 cell and its biological effect.Prog Mod Biomed (現代生物醫學進展)，2009，9:1769-1772.

8 Ma XM (馬興銘)，Ding JB (丁劍冰).Medical Immunology(醫學免疫學).Beijing:Tsinghua University Press，2013.127-128.

9 Hu JH (胡錦輝)，Bi SL (畢勝利)，Lv Y (呂元).The Th17 cell is gradually gaining in-depth study.Chin J Immu(中國免疫學雜志)，2012，28:372-378.

10 Cheng JY (程佳音)，Lv XX (呂小迅).Research progress in regulatory T cells.Acad J Guangdong Pharm Coll (廣東藥學院學報)，2012，28:102-107.

11 Li R，Chen W，Wang W，et al.Extraction，characterization of Astragalus polysaccharide and its immune modulating activities in rats with gastric cancer.Carbohydr Polym，2009，78:738-742.

12 Chen W (陳蔚)，Li YM (李益明)，Yu MH (俞茂華)，et al.Immunoloregulation effects of Astragalus polysaccharides on T helper lymphocyte subgroups in nonobese diabetic mice.Chin J Mod Med (中國現代醫學雜志)，2007，17:28-32.

13 Yuan XJ (苑曉娟)，Fan WP (樊衛平)，Zhang K (張凱)，et al.Regulatory effect of low dose cyclophosphamide on CD4+CD25+Treg cells in mice.Immu J (免疫學雜志)，2011，27:292-296.